Galvenā atšķirība - RAPD un RFLP
Ģenētiskie marķieri tiek izmantoti molekulārajā bioloģijā, lai identificētu ģenētiskās variācijas starp indivīdiem un sugām. Random Amplified Polymorphic DNS (RAPD) un Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) ir divi svarīgi molekulārie marķieri, ko regulāri izmanto laboratorijās. RAPD tiek veikta ar īsiem un patvaļīgiem oligonukleotīdu primeriem, un tā pamatā ir vairāku vietu nejauša pastiprināšana visā organisma veidnes DNS. RFLP tiek veikta ar specifisku restrikcijas endonukleāzi, un tā ir balstīta uz iegūto restrikcijas fragmentu polimorfismu un hibridizāciju. Galvenā atšķirība starp RAPL un RFLP ir tāda, ka RAPD ir PCR tehnikas veids, ko veic bez iepriekšējas secības zināšanām, turpretim RFLP nav iesaistīta PCR, un, lai veiktu šo metodi, ir nepieciešamas iepriekšējas zināšanas par secību.
Kas ir RAPD?
RAPD ir noderīgs molekulārais marķieris molekulārajā bioloģijā. Tā ir ātra un vienkārša tehnika. RAPD var definēt kā metodi, kuras rezultātā tiek iegūtas polimorfas DNS sekvences vairāku mērķa DNS veidnes vietu nejaušas amplifikācijas rezultātā. PCR amplifikācijai RAPD izmanto īsus oligonukleotīdu praimerus ar patvaļīgām sekvencēm. Primeri tiek mākslīgi sintezēti bez iepriekšējas secības zināšanām. Tāpēc to uzskata par vieglu un noderīgu tehniku.
Tālāk norādītās galvenās darbības ir saistītas ar RAPD.
- Mērķa DNS ekstrakcija
- Mērķa DNS vairāku atrašanās vietu amplifikācija, izmantojot nejauši izvēlētus primerus
- Amplificēto PCR produktu gēla elektroforēze
- Krāsošana ar etīdija bromīdu un polimorfisma identificēšana
Primera atkausēšanas variāciju rezultātā amplifikācijas laikā tiek ģenerēti dažādi fragmenti ar dažādu garumu. Tādējādi želeju joslu raksti indivīdiem un sugām atšķiras. Tādējādi RAPD ļauj noteikt ģenētiskās variācijas starp organismiem identifikācijā un diferenciācijā.
RAPD tiek izmantots dažādos molekulārās bioloģijas pētījumos, piemēram, ģenētisko atšķirību identificēšanā starp cieši radniecīgām sugām, gēnu kartēšanu, DNS pirkstu nospiedumu noņemšanu, iedzimtu slimību identificēšanu utt.
Attēls 01: RAPD
Kas ir RFLP?
Ierobežojuma fragmenta garuma polimorfismi (RFLP) ir molekulārais marķieris, ko izmanto molekulārajā bioloģijā, lai identificētu ģenētiskās variācijas homologās DNS sekvencēs. Tas ir pirmais ģenētiskais marķieris, kas izstrādāts DNS pirkstu nospiedumu noņemšanai. Visi organismi rada unikālus DNS profilus, ja tos ierobežo specifiski restrikcijas enzīmi. RFLP kalpo kā svarīgs instruments unikālu indivīdu DNS profilu izveidošanai un ģenētisko variāciju noteikšanā starp tiem. Kad DNS paraugi tiek sagremoti ar specifiskām restrikcijas endonukleāzēm, tiek iegūti dažādi DNS profili, kas ir unikāli katram indivīdam. Tāpēc šīs metodes pamatprincips ir ģenētisko variāciju noteikšana starp organismiem, ierobežojot homologu DNS ar specifiskiem restrikcijas enzīmiem, un fragmentu garuma polimorfisma analīze, izmantojot gēla elektroforēzi un blotēšanu. Blotēšanas modeļi ir unikāli katram organismam un raksturo konkrētos genotipus.
Ar RFLP ir saistītas šādas darbības.
- Pietiekama DNS daudzuma izolēšana no paraugiem
- DNS paraugu fragmentēšana ar specifiskām restrikcijas endonukleāzēm īsā secībā
- Iegūto dažāda garuma fragmentu atdalīšana ar agarozes gēla elektroforēzi.
- Gēla profila pārvietošana uz membrānu, izmantojot Southern blotēšanu
- Membrānas hibridizācija ar iezīmētām zondēm un fragmenta garuma polimorfisma analīze katrā profilā
RFLP ir dažādas lietojumprogrammas, piemēram, iedzimtu slimību diagnostika, genoma kartēšana, kriminālo identifikācija tiesu medicīnas pētījumos, paternitātes pārbaude utt.
2. attēls: RFLP genotipēšana
Kāda ir atšķirība starp RAPD un RFLP?
RAPD pret RFLP |
|
| RAPD ir molekulārais marķieris, kas balstīts uz nejaušiem primeriem un PCR. | RFLP ir molekulārais marķieris, kura pamatā ir dažāda garuma ierobežojuma fragmentu ražošana. |
| Nepieciešams paraugs | |
| RAPD analīzei pietiek ar maziem DNS paraugiem. | RFLP analīzei ir nepieciešams liels daudzums ekstrahēta DNS parauga. |
| Laiks | |
| RAPD ir ātrs process. | RFLP ir laikietilpīgs process. |
| Primer Use | |
| Tiek izmantoti izlases veida primeri, un tos pašus primerus var izmantot dažādām sugām. | Sugai specifiskas zondes izmanto RFLP hibridizācijai. |
| Uzticamība | |
| Tehnikas uzticamība ir mazāka salīdzinājumā ar RFLP. | RFLP ir uzticama tehnika. |
| Blotting | |
| RAPD ietver dienvidu blotēšanu. | Southern blotting ir viens RFLP solis. |
| Alēlisko variāciju noteikšana | |
| RAPD nevar noteikt aleliskās variācijas. | Alēliskās variācijas var noteikt RFLP. |
| Nepieciešamas secības zināšanas | |
| RAPD neprasa iepriekšējas secības zināšanas. | Zondes projektēšanai ir nepieciešamas iepriekšējas secības zināšanas. |
| PCR | |
| PCR ir saistīta ar RAPD | PCR nav saistīta ar RFLP. |
| Reproducējamība | |
| RAPD ir zema reproducējamība | RFLP ir augsta reproducējamība salīdzinājumā ar RAPD. |
Kopsavilkums - RAPD pret RFLP
RAPD un RFLP ir svarīgi marķieri, ko izmanto molekulārajā bioloģijā. Abas metodes spēj noteikt ģenētiskās variācijas starp organismiem. RAPD tiek veikta, izmantojot izlases primerus. RFLP tiek veikta, izmantojot specifiskus restrikcijas enzīmus. Abas metodes rada DNS profilus, kas ir unikāli atsevišķiem organismiem. RAPD ir iesaistīts salīdzinoši nedaudzos posmos nekā RFLP. Bet tas rada mazāk ticamus un reproducējamus rezultātus nekā RFLP. Šī ir galvenā atšķirība starp RAPD un RFLP.
