Galvenā atšķirība - AFLP vs RFLP
DNS pētījumiem ir milzīga nozīme filoģenētisko attiecību izpratnē un noteikšanā, ģenētisko slimību diagnostikā un organisma genomu kartēšanā. Vairākas metodes, kas saistītas ar DNS analīzi, tiek izmantotas arī konkrēta gēna vai DNS sekvences identificēšanai nezināmas DNS kopā. Tie ir pazīstami kā molekulārie marķieri. Pastiprināta fragmenta garuma polimorfisms (AFLP) un ierobežojuma fragmenta garuma polimorfisms (RFLP) ir divi šādi molekulārie marķieri (metodes), kas izstrādāti molekulārajā bioloģijā, lai noteiktu ģenētiskās variācijas starp organismiem. Abas metodes ir vienlīdz svarīgas, un tām ir priekšrocības un trūkumi. Galvenā atšķirība starp AFLP un RFLP ir tāda, ka AFLP ietver selektīvu sagremotās DNS PCR amplifikāciju, savukārt RFLP neietver selektīvu DNS fragmentu PCR amplifikāciju.
Kas ir AFLP?
AFLP (amplified Fragment Length Polymorphism) ir svarīgs instruments molekulārajā bioloģijā, un to plaši izmanto ģenētisko variāciju analīzē. AFLP pamatā ir specifiska fragmentētās genoma DNS PCR amplifikācija un polimorfisma noteikšana ar autoradiogrāfiem, izmantojot gēla elektroforēzi. AFLP plaši palīdz identificēt ģenētiskās atšķirības dažādu valstību, tostarp augu, dzīvnieku, baktēriju un sēņu celmos vai cieši radniecīgos sugās. AFLP var veikt ar nelielu daudzumu nezināmu DNS paraugu. Tam nav nepieciešamas iepriekšējas secības zināšanas un zondu projektēšana.
AFLP soļi
- DNS izolācija
- DNS gremošana ar restrikcijas endonukleāzēm
- Ierobežoto DNS fragmentu ligēšana ar adapteriem
- Fragmentu selektīva pastiprināšana ar īpašām restrikcijas vietām
- PCR produktu atdalīšana ar gēla elektroforēzi
- Gēla matricas vizualizācija ar autoradiogrāfu
AFLP ir jutīgāka un reproducējamāka metode, ko var izmantot vairāku taksonu, tostarp sēnīšu, baktēriju, augu un dzīvnieku, DNS profilēšanai bez priekšzināšanām par DNS sekvencēm. Tas palīdz noteikt nelielas atšķirības starp indivīdiem populācijās tā ļoti jutīgā rakstura dēļ. AFLP ir svarīga arī genoma kartēšanā, kriminālistikas pētījumos, vecāku pārbaudēs, genotipa noteikšanā utt.
Attēls 01: AFLP
Kas ir RFLP?
Ierobežojuma fragmenta garuma polimorfismi (RFLP) ir metode, ko izmanto, lai noteiktu ģenētiskās variācijas homologās DNS sekvencēs. Tā ir pirmā metode, kas izstrādāta DNS profilēšanai. Organismiem ir unikāli DNS pirkstu nospiedumi vai DNS profili. RFLP kalpo kā svarīgs instruments, lai analizētu atšķirības starp intraspecifisku vai cieši saistītu organismu DNS profiliem, jo homologām sekvencēm ir dažādas restrikcijas vietas (atrašanās vietas), kas ir unikālas konkrētam organismam. Ja homologā DNS tiek sagremota ar specifiskām restrikcijas endonukleāzēm, tas radīs dažādus DNS profilus, kas ir unikāli katram indivīdam. Tāpēc šīs metodes pamatprincips ir ģenētisko variāciju noteikšana starp organismiem, ierobežojot homologu DNS ar specifiskiem restrikcijas enzīmiem, un fragmentu garuma polimorfisma analīze, izmantojot gēla elektroforēzi un blotēšanu. Blotēšanas modeļi ir unikāli katram organismam un raksturo konkrētos genotipus.
RFLP soļi
- Pietiekama DNS daudzuma izolēšana no paraugiem
- DNS paraugu fragmentēšana ar specifiskām restrikcijas endonukleāzēm īsā secībā
- Iegūto dažāda garuma fragmentu atdalīšana ar agarozes gēla elektroforēzi.
- Gēla profila pārvietošana uz membrānu, izmantojot Southern blotēšanu
- Membrānas hibridizācija ar iezīmētām zondēm un fragmenta garuma polimorfisma analīze katrā profilā
RFLP ir ļoti svarīgs paņēmiens slimības pārmantojuma noteikšanā un slimības rašanās riska noteikšanā ģimenes locekļu vidū. RFLP arī bieži izmanto genoma kartēšanā, noziedznieku identificēšanā kriminālistikā, paternitātes pārbaudē utt. RFLP ir arī vairāki ierobežojumi. Lai izstrādātu zondes hibridizācijai, RFLP ir nepieciešamas priekšzināšanas par secību datiem. Tas arī prasa no parauga izolēt pietiekamu daudzumu DNS, lai analizētu, kas ir sarežģīti tiesu medicīnas pētījumos.
Attēls 01: RRFLP kartēšana
Kāda ir atšķirība starp AFLP un RFLP?
ALFP pret RFLP |
|
| AFLP ietver selektīvu sagremotās DNS PCR pastiprināšanu. | RFLP neietver PCR, ja vien tā nav PCR-RFLP. |
| Secības zināšanas | |
| Iepriekšējas secības zināšanas nav nepieciešamas. | Lai izstrādātu RFLP zondes, ir nepieciešamas iepriekšējas secības zināšanas. |
| Uzticamība | |
| Tas ir uzticamāks. | Tas ir mazāk uzticams salīdzinājumā ar AFLP. |
| Efektivitāte polimorfisma noteikšanā | |
| Tam ir augstāka efektivitāte polimorfisma noteikšanā nekā RFLP. | Tas ir mazāk efektīvs salīdzinājumā ar AFLP. |
| Izmaksas | |
| Tas ir nedaudz dārgs salīdzinājumā ar RFLP. | Tas ir lētāks salīdzinājumā ar AFLP. |
| Applications | |
| AFLP ir izmantotas genoma kartēšanā, DNS pirkstu nospiedumu noņemšanā, ģenētiskās daudzveidības pētījumos, paternitātes pārbaudēs un tiesu ekspertīzēs | RFLP analīze ir svarīgs rīks genoma kartēšanā, ģenētisko traucējumu gēnu lokalizācijā, slimības riska noteikšanā un paternitātes pārbaudē. |
Kopsavilkums - AFLP pret RFLP
AFLP un RFLP ir divas metodes, ko izmanto kā ģenētiskos marķierus daudzveidības un ģenētisko attiecību novērtēšanai molekulārajā bioloģijā. AFLP kalpo kā efektīva un jutīga metode ģenētiskā polimorfisma noteikšanai starp organismiem nekā RFLP. Tomēr, lai gan abām šīm metodēm ir atšķirīga efektivitāte ģenētisko variāciju noteikšanā, tās joprojām tiek izmantotas DNS pirkstu nospiedumu noņemšanai un slimību diagnostikai.
