PCR pret reāllaika PCR
PCR jeb polimerāzes ķēdes reakcija ir revolucionārs atklājums mūsdienu molekulārajā bioloģijā, ko pirmo reizi izstrādāja ķīmiķis Karijs Mulliss 1983. gadā. Tas ļauj analizēt vienu secību kompleksā DNS. PCR pamatideja ir tāda, ka divi primeri, kas ir komplementāri DNS sekvences pretējām virknēm, ir orientēti viens pret otru; primeri rada komplementāras šķipsnas, no kurām katra satur otru grunti. Tādējādi rezultāts ir liels daudzums sekvences, kas atbilst DNS, kas atrodas starp diviem primeriem. DNS polimerāzes enzīms tiek izmantots, lai paplašinātu primerus PCR. DNS polimerāze ir termostabils enzīms, un tas spēj izdzīvot augstā temperatūrā (94 līdz 95 °C), ko izmanto DNS veidnes denaturēšanai.
PCR ietver trīs posmus, proti, atkārtotas denaturēšanas kārtas, primeru atkausēšanu un DNS sintēzi. Šīs reakcijas veikšanai tiek izmantota termociklera iekārta, lai to varētu ieprogrammēt ātri un precīzi mainīt temperatūru. PCR lietojums ir kriminālizmeklēšana, DNS pirkstu nospiedumi, patogēnu noteikšana un agrīnu cilvēku sugu DNS analīze.
Kas ir parastā PCR?
Ir trīs galvenie parastās PCR posmi, proti; DNS amplifikācijas posms, PCR atdalīšana un produktu noteikšana. DNS segmentu atdalīšanu parasti veic ar agarozes gēla elektroforēzi. Pēc tam produktus iekrāso ar eteiduimbromīdu. Visbeidzot, noteikšana tiek panākta, vizualizējot joslas uz gēliem UV gaismā. Tāpēc parastās PCR galīgie rezultāti nav izteikti skaitļos. Parasti parastā PCR spēj noteikt tikai vienu parametru.
Kas ir reāllaika PCR?
Reāllaika PCR var noteikt produktu pastiprināšanos, jo produkti tiek sintezēti. Attīstoties tehnoloģijai, PCR ir kļuvusi par ļoti populāru paņēmienu, īpaši baktēriju noteikšanai un identificēšanai pārtikas produktos. Reāllaika PCR izmanto fluorescējošu krāsu sistēmu un termocikleru, kas aprīkots ar fluorescējošās spuldzes noteikšanas iespēju.
Kāda ir atšķirība starp parasto PCR un reāllaika PCR?
• Parastā PCR ir laikietilpīgāka, jo tā izmanto gēla elektroforēzi, lai analizētu pastiprinātos PCR produktus. Turpretim reāllaika PCR ir mazāk laikietilpīga, jo tā var noteikt pastiprināšanos reakcijas sākuma fāzēs.
• Reāllaika PCR apkopo datus PCR eksponenciālās augšanas fāzē, savukārt tradicionālā PCR vāc datus reakcijas beigu punktā.
• Parastā PCR beigu punktu rezultāti var nebūt ļoti precīzi, taču reāllaika PCR rezultāti ir ļoti precīzi.
• Reāllaika PCR ir jutīgāka nekā parastā PCR.
• Parastajai PCR ir ļoti slikta izšķirtspēja, savukārt reāllaika PCR var noteikt ļoti nelielas izmaiņas augstās izšķirtspējas dēļ.
• Parastā PCR beigu punkta noteikšanai ir īss dinamiskais diapazons, savukārt reāllaika PCR noteikšanai ir plašs dinamiskais diapazons.
• Atšķirībā no parastās PCR, automātiskās noteikšanas metodes ir atrodamas reāllaika PCR.
• Parastā PCR ir ļoti sarežģīta un darbietilpīga vairāk nekā reāllaika PCR.
• Atšķirībā no reāllaika PCR, parastā PCR nevar atšķirt mirušās un dzīvās baktērijas.
• Reāllaika PCR izmanto fluorescējošu krāsu sistēmu, lai noteiktu produktus, savukārt parastajā PCR izmanto etīdija bromīdu un UV gaismu, lai vizualizētu joslas agarozes gēla vidē.
