Galvenā atšķirība starp parastajiem ligzdotajiem un reāllaika PCR testiem ir tāda, ka parastā PCR ir metode, kas izstrādāta, lai pastiprinātu specifiskas DNS sekvences, un ligzdotā PCR ir tradicionālās PCR modifikācija, kas sastāv no divām secīgām amplifikācijas reakcijām, bet reālā -laika PCR ir parastās PCR variants, kas spēj kvantitatīvi noteikt pastiprināto produktu.
PCR ir ļoti izplatīta zinātniska metode, ko plaši izmanto pētniecībā un medicīnā DNS noteikšanai. PCR testus izmanto, lai noteiktu antigēnus, nosakot to DNS vai RNS. Parasti vīrusa RNS organismā atrodas pirms antivielu noteikšanas vai slimības simptomu parādīšanās. PCR tests var noteikt, vai kādam vīruss ir vai nav agri. Pašlaik PCR ir standarta tests COVID-19 slimības noteikšanai. Ir dažādi PCR paņēmienu veidi, piemēram, reāllaika PCR, ligzdotā PCR, multipleksā PCR, karstās palaišanas PCR un liela attāluma PCR utt.
Kas ir parastie PCR testi?
Konvencionālais PCR tests ir in vitro DNS amplifikācijas metode, ko regulāri veic molekulāri bioloģiskajās laboratorijās. Šī metode ļāva izgatavot no tūkstošiem līdz miljoniem konkrēta DNS fragmenta kopiju. Karijs Mulliss šo paņēmienu ieviesa 1980. gadā. Lai veiktu daudzas tā kopijas, ir nepieciešams DNS fragments, kas pazīstams kā veidne. Taq polimerāze darbojas kā DNS polimerāzes enzīms un katalizē veidnes secības jaunu virkņu sintēzi.
Pimeri PCR maisījumā darbosies kā fragmentu paplašinājumu sākumpunkti. Visas sastāvdaļas, kas nepieciešamas DNS kopiju izgatavošanai, ir iekļautas PCR maisījumā. PCR reakcija tiek veikta PCR iekārtā, un tā jābaro ar pareizo PCR maisījumu un pareizo PCR programmu. Ja reakcijas maisījums un programma ir pareiza, tas no ļoti neliela DNS daudzuma izveidos nepieciešamo konkrētas DNS sadaļas kopiju skaitu.
Attēls 01: Parastais PCR tests
PCR reakcijā ir iesaistīti trīs galvenie posmi: denaturācija, grunts atkausēšana un virknes pagarināšana. Šīs trīs darbības notiek trīs dažādās temperatūrās. PCR buferis uztur optimālos apstākļus Taq polimerāzes darbībai. Šīs trīs PCR reakcijas stadijas tiek atkārtotas, lai iegūtu nepieciešamo PCR produkta daudzumu. Katrā PCR reakcijā DNS kopiju skaits dubultojas. Tādējādi PCR var novērot eksponenciālu amplifikāciju. PCR produktu var atdalīt, izmantojot gēla elektroforēzi, jo tas rada redzamu DNS daudzumu uz gēla, un to var attīrīt turpmākiem pētījumiem, piemēram, sekvencēšanai.
PCR ir vērtīgs instruments medicīniskajā un bioloģiskajā pētniecībā. Īpaši kriminālistikas pētījumos PCR ir milzīga vērtība, jo tā var pastiprināt DNS pētījumiem no sīkajiem noziedznieku paraugiem un izveidot kriminālistikas DNS profilus. PCR tiek plaši izmantots daudzās molekulārās bioloģijas jomās, tostarp genotipa noteikšanā, gēnu klonēšanā, mutāciju noteikšanā, DNS sekvencēšanā, DNS mikromasuvēs un paternitātes pārbaudē.
Kas ir Nested PCR testi?
Nested PCR ir PCR veids, kas samazina DNS nespecifisko amplifikāciju. Nested PCR testā ir divi secīgi PCR vai divas secīgas amplifikācijas reakcijas. Pirmās amplifikācijas reakcijas laikā tiek ražots PCR produkts. Pēc pirmās reakcijas pirmās reakcijas PCR produktam tiek veikta otrā amplifikācijas reakcija. Tāpēc praimeri otrajā reakcijas maisījumā saistās ar pirmo PCR produktu un pastiprina to.
2. attēls: ligzdots PCR
Primer pāri katrā reakcijā ir atšķirīgi. Primeru nespecifiskā saistīšanās tiek samazināta ligzdotajā PCR. Nested PCR testi ir noderīgi, lai palielinātu jutību un/vai specifiskumu. Tomēr ligzdotajam PCR ir nepieciešamas zināšanas par interesējošo secību.
Kas ir reāllaika PCR testi?
Reāllaika PCR jeb kvantitatīvā PCR (Q PCR) ir modificēta PCR versija, kas kvantitatīvi mēra PCR produktus. Tāpēc šī metode kvantitatīvi nosaka pastiprinājumu reāllaikā, izmantojot reāllaika PCR iekārtu. Tā ir arī piemērota metode, lai noteiktu paraugā esošās mērķa sekvences vai gēna daudzumu.
Reāllaika PCR interesanta iezīme ir tā, ka tā vienā darbībā apvieno gan pastiprināšanu, gan patieso kvantitatīvo noteikšanu. Tāpēc vajadzību pēc gēla elektroforēzes noteikšanai var novērst, izmantojot reāllaika PCR metodi. Fluorescējošu krāsvielu izmantošana PCR produktu marķēšanai PCR reakciju laikā galu galā novedīs pie tiešas kvantitatīvās noteikšanas. Kad tiek uzkrāti PCR produkti, tiek uzkrāti arī fluorescējošie signāli, un tos mērīs reāllaika iekārta. SYBR Green un Taqman ir divas metodes, lai noteiktu vai vērotu reāllaika PCR pastiprināšanas procesu. Abas metodes uzrauga pastiprināšanas procesa gaitu un ziņo par produkta daudzumu reāllaikā.
03. attēls: reāllaika PCR
Reāllaika PCR ir plašs lietojumu klāsts, piemēram, gēnu ekspresijas kvantitatīva noteikšana, mikroRNS un nekodējošās RNS analīze, SNP genotipēšana, kopiju skaita variantu noteikšana, retu mutāciju noteikšana, ģenētiski modificētu organismu noteikšana un infekcijas izraisītāju noteikšana.
Kādas ir līdzības starp parastajiem ligzdotajiem un reāllaika PCR testiem?
- Nested un reāllaika PCR testi ir parastā PCR testa modifikācijas.
- Visas trīs metodes pastiprina DNS paraugus.
- Viņu produktus var izmantot secībā vai analīzē.
- Šiem testiem ir nepieciešami primeri.
Kāda ir atšķirība starp parastajiem ligzdotajiem un reāllaika PCR testiem?
Konvencionālā PCR ir metode, kas izstrādāta, lai pastiprinātu specifiskas DNS sekvences. Tikmēr Nested PCR ir parastā PCR modifikācija, kas sastāv no divām secīgām amplifikācijas reakcijām, un reāllaika PCR ir tradicionālās PCR variants, kas spēj kvantitatīvi noteikt pastiprināto produktu. Tātad, šī ir galvenā atšķirība starp parastajiem ligzdotajiem un reāllaika PCR testiem. Atšķirībā no parastās un reāllaika PCR, ligzdotajā PCR izmanto divas primeru kopas. Turklāt ligzdotajā PCR ir divas secīgas amplifikācijas reakcijas, lai samazinātu nespecifisko amplifikāciju. turklāt tradicionālie un reālā laika PCR testi nesatur divas secīgas amplifikācijas reakcijas.
Šajā infografikā tabulas veidā ir norādītas atšķirības starp parastajiem ligzdotajiem un reāllaika PCR testiem, lai salīdzinātu tos.
Kopsavilkums - parastie un ligzdotie un reāllaika PCR testi
Konvencionālā PCR ir pirmā metode, kas izstrādāta konkrētu DNS fragmentu pastiprināšanai. Nested PCR un reāllaika PCR ir divi tradicionālās PCR varianti. Ir divas secīgas amplifikācijas reakcijas un divu praimeru komplektu izmantošana ligzdotajā PCR. Reāllaika PCR ir izstrādāts, lai kvantitatīvi noteiktu pastiprināto PCR produktu. Tādējādi tas apkopo atšķirību starp parastajiem ligzdotajiem un reālā laika PCR testiem.
