Galvenā atšķirība - nitroceluloze pret PVDF
Western blotēšana ir metode, kas ļauj noteikt un kvantitatīvi noteikt specifiskus proteīnus no proteīna parauga. Metodes uzticamība ir atkarīga no pareizas membrānas izvēles proteīnu uzsūkšanai no gēla. Ir dažādi mikroporaino membrānu veidi. Nitrocelulozes un PVDF membrānas ir divas šādas membrānas, kuras pētnieki dod priekšroku to īpašo īpašību dēļ salīdzinājumā ar citiem membrānu veidiem. Izvēle starp nitrocelulozi vai PVDF ir arī vēl viens izaicinājums Western blotēšanai. Gan nitrocelulozei, gan PVDF ir augsta olb altumvielu absorbcijas spēja. Galvenā atšķirība starp nitrocelulozi un PVDF membrānu ir tāda, ka nitrocelulozes membrānas nespēj atdalīt antivielas un atkārtoti izmantot membrānu antivielu atkārtotai noteikšanai, savukārt PVDF membrānām ir atdalīšanas un atkārtotas izmantošanas spēja.
Kas ir nitroceluloze?
Nitroceluloze ir polimērs, ko ražo, apstrādājot celulozi ar slāpekļskābi, un to izmanto, lai izveidotu mikroporainas membrānas molekulārajā bioloģijā, īpaši blotēšanas metodēm, piemēram, dienvidu, ziemeļu un rietumu blotēšanai. Nitrocelulozes membrānu poru izmērs ir no 3 līdz 20 µm. Nitrocelulozes mikroporainās membrānas atvieglo imūnķīmisko reakciju noteikšanu, kas notiek uz membrānas virsmas. Tāpēc nitrocelulozes membrānas bieži izmanto proteīnu imobilizācijai un specifisku proteīnu noteikšanai Western blot metodē. Nitrocelulozes membrānas var arī imobilizēt glikoproteīnus un nukleīnskābes.
Sānu plūsmas testos priekšroka tiek dota nitrocelulozes membrānām vairāku īpašību dēļ. Nitrocelulozes membrānas absorbē olb altumvielas augstā koncentrācijā. Šķīdinātājs, ko izmanto membrānas mitrināšanai, nemazina nitrocelulozes membrānas proteīna uzsūkšanos. Nitrocelulozes membrānas var viegli sagriezt līdz vajadzīgajam gēla izmēram un pārnest proteīnus no gēla uz membrānu ar elektrisku vai kapilāru pārnesi. Nitroceluloze nodrošina ātrāku olb altumvielu plūsmu caur membrānu ar augstu saistīšanās potenciālu. Nitroceluloze uzrāda uzlabotu vadāmību. Vēl viena īpaša nitrocelulozes membrānas īpašība ir tā, ka to var viegli pielīmēt ar ūdensnecaurlaidīgām līmēm uz dažādām plastmasas pamatnēm.
Attēls 01: Nitrocelulozes membrāna Western blotēšanai
Kas ir PVDF?
Polivinilidēna difluorīds (PVDF) ir fluorpolimērs, ko iegūst, polimerizējot vinilidēna difluorīdu, un tam ir augsta proteīnu imobilizācijas spēja. Tāpēc no PVDF izgatavotas mikroporainas membrānas tiek izmantotas Western blot metodēs, lai analizētu specifiskus proteīnus no proteīnu maisījumiem. PVDF membrānas var izmantot arī aminoskābju analīzei un olb altumvielu sekvencēšanai. Vissvarīgākā PVDF membrānas īpašība virs nitrocelulozes membrānas ir tā, ka to var viegli noņemt no antivielām un atkārtoti izmantot turpmākajām antivielu zondēm.
PVDF membrānas ir biezākas nekā nitrocelulozes membrānas; tādējādi tas ir izturīgāks pret bojājumiem atkārtotas lietošanas laikā. PVDF membrānas ir ļoti hidrofobas. Tāpēc pirms lietošanas tie ir jāizmērcē metanolā vai izopropanolā.
Kāda ir atšķirība starp nitrocelulozi un PVDF?
Nitroceluloze pret PVDF |
|
| Nitroceluloze ir polimērs, kas sastāv no celulozes. | PVDF ir fluorpolimērs, ko iegūst, polimerizējot vinilidēna difluorīdu. |
| Membrānas poru izmērs | |
| Tipiski poru izmēri ir 0,1, 0,2 vai 0,45 μ | Tipiski poru izmēri ir 0,1, 0,2 vai 0,45 μm |
| Olb altumvielu saistīšanas kapacitāte | |
| Nitrocelulozes proteīnu saistīšanās spēja ir no 80 līdz 100 μg/cm2. | PVDF proteīnu saistīšanās spēja ir no 170 līdz 200 μg/cm2. |
| Jūtība | |
| Šai ir zema jutība salīdzinājumā ar PVDF. | Tam ir augsta jutība. |
| Vāji izteiktu proteīnu noteikšana | |
| Tā kā nitrocelulozes membrānās ir zema jutība, tā nav piemērota vāji izteiktu proteīnu noteikšanai. | Tas ir vairāk piemērots vāji izteiktu proteīnu noteikšanai augstās jutības dēļ. |
| Fona troksnis | |
| Tam ir zemāks fona troksnis | Tam ir lielāks fona troksnis. |
| Mijiedarbība ar olb altumvielām | |
| Olb altumvielu molekulas saistās ar nitrocelulozes membrānām, izmantojot hidrofobu mijiedarbību. | Proteīni saistās ar PVDF membrānām, izmantojot hidrofobu un dipolu mijiedarbību. |
| Membrānas daba | |
| Nitroceluloze ir trausla un trausla. Tomēr ir pieejamas nitrocelulozes versijas, un tās ir izturīgas. | PVDF ir izturīgāks un tam ir augstāka ķīmiskā izturība. |
| Iespēja noņemt un atkārtoti izmantot | |
| Nitrocelulozei var būt grūtības noņemt un atkārtot zondēšanu, nezaudējot signālu. | PVDF ir ideāli piemērots atkārtotas zondēšanas un secības noteikšanai. |
| Piemērotība | |
| Nitroceluloze ir ideāli piemērota zemas molekulmasas olb altumvielu noteikšanai. | PVDF ir vairāk piemērots lielākas molekulmasas proteīnu noteikšanai. |
| Citi lietojumi | |
| Nitrocelulozi var izmantot nukleīnskābju analīzei un dot/slot blotēšanai. | PVDF var izmantot proteīnu sekvencēšanai un cietās fāzes testu sistēmām. |
| Izmaksas | |
| Tas ir lētāks nekā PVDF membrānas. | Tas ir dārgāks nekā nitrocelulozes membrānas. |
| Nepieciešams iepriekšēja mitrināšana | |
| Nitrocelulozes membrānām nav nepieciešama iepriekšēja mērcēšana ar metanolu | PVDF membrānām nepieciešama iepriekšēja mērcēšana ar metanolu. |
Kopsavilkums - nitroceluloze pret PVDF
Nitrocelulozes membrānas bija pirmās membrānas, ko komerciāli izmantoja sānu plūsmas testiem. Viņiem ir augsta proteīnu absorbcijas spēja. Tāpēc Western blotting izmanto nitrocelulozes membrānas. PVDF ir cita veida membrāna, ko izmanto Western blotēšanai, un tai ir arī augsta olb altumvielu absorbcijas spēja. Abus veidus izmanto Western blotting proteīnu analīzei. Tomēr PVDF membrānām ir vairāk īpašu īpašību, kas padara tās piemērotākas nekā nitrocelulozes membrānas Western blotēšanai. Bet nitrocelulozes membrānas ir piemērotākas zemas molekulmasas proteīnu noteikšanai, PVDF membrānas ir vairāk piemērotas augstas molekulmasas proteīnu noteikšanai. Šī ir atšķirība starp nitrocelulozes un PVDF membrānām.
