Galvenā atšķirība starp Golden Gate un Gibson Assembly ir tāda, ka Golden Gate paļaujas uz restrikcijas vietu klātbūtni noteiktā klonējamā secībā, savukārt Gibson Assembly nepaļaujas uz restrikcijas vietu klātbūtni noteiktā secībā, lai. tikt klonētam.
Pēdējo desmitgažu laikā molekulārie zinātnieki ir izstrādājuši dažādas standartizētas procedūras, kas ļauj vieglāk salikt vairākus DNS fragmentus vienā gabalā. Tāpēc pētnieki zinātniskos eksperimentos plaši izmanto tādas klonēšanas metodes kā restrikcijas enzīmu ligācija, vārtejas klonēšana, Gibsona montāža, Golden Gate Assembly un TOPO klonēšana. Tāpēc Golden Gate un Gibson Assembly ir divas molekulārās klonēšanas metodes, kas ļauj apvienot vairākus DNS fragmentus vienā gabalā.
Kas ir Golden Gate Assembly?
Golden Gate ir molekulārā klonēšanas metode, kas atvieglo vairāku DNS fragmentu salikšanu vienā gabalā. Šī metode balstās uz restrikcijas vietu klātbūtni noteiktā klonējamā secībā. Tā radās 1996. gadā. Šajā paņēmienā tiek izmantoti IIS tipa restrikcijas enzīmi un T4 DNS ligāze. Šie fermenti sagriež DNS ārpus atpazīšanas vietām. Tie var radīt nepalindromiskas pārkares. Tāpēc vairākus DNS fragmentus var salikt, izmantojot pārkares secību kombinācijas.
01. attēls: Zelta vārti
Zelta vārtu montāžas procedūra
Zelta vārtu tehnikai ir trīs galvenie darbības soļi:
- pārkares izveidošana klonēšanas vektorā,
- vairāku DNS ieliktņu montāža, izmantojot fragmentiem specifiskas sekvences pārkarēs, un
- ligācija.
Golden Gate montāža izmanto apļveida klonēšanas vektorus (galamērķa vektoru). Turklāt, izmantojot šo metodi, restrikcijas vieta tiek izvadīta no ligētā produkta, lai vienlaikus veiktu gremošanu un ligāšanu. Tipisks Golden Gate termiskā cikla protokols svārstās no 37 °C līdz 16 °C, jo 37 °C ir optimāls restrikcijas enzīmiem un 16 °C ir optimāls ligāzēm.
Kas ir Gibson Assembly?
Gibson Assembly ir molekulārā klonēšanas metode, kas ļauj apvienot vairākus DNS fragmentus vienā gabalā. Atšķirībā no Golden Gate metodes, šī metode nepaļaujas uz restrikcijas vietu klātbūtni noteiktā klonējamā secībā. To atrada Daniels G. Gibsons no J. Kreiga Ventera institūta. Šī metode ir no sekvences un ligazes neatkarīgās klonēšanas (SLIC) metodes.
Attēls 02: Gibsona montāža
Gibsona montāžas procedūra
Gibson Assembly nepieciešami DNS fragmenti, kas satur 20–40 bāzes pārus, kas pārklājas ar blakus esošajiem DNS fragmentiem. Pārklāšanās tiek pievienota, izmantojot PCR. Pēc tam šos DNS fragmentus pievieno Gibsona masera maisījumam, kurā ir trīs fermenti. Šo procedūru veic izotermiskos apstākļos (50 °C 1 stundu), izmantojot trīs dažādus enzīmus: eksonukleāzi, DNS polimerāzi un DNS ligāzi. Eksonukleāze košļā atpakaļ DNS no 5' gala. Tādējādi tas neinhibē polimerāzes aktivitāti un ļauj reakcijai noritēt vienā procesā. Iegūtos vienpavedienu reģionus blakus esošajos DNS fragmentos var atkausēt sekvenču pārklāšanās dēļ. DNS polimerāze aizpilda spraugas, pievienojot nukleotīdus. Visbeidzot, DNS ligāze kovalenti savienojas ar blakus esošo segmentu DNS. Parasti Gibson Assembly izmanto linearizētus mērķa vektorus. Turklāt šī metode var vienlaikus apvienot līdz pat 15 DNS fragmentiem, pamatojoties uz secību līdzību.
Līdzības starp Golden Gate un Gibson Assembly
- Golden Gate un Gibson Assembly ir divas molekulārās klonēšanas metodes.
- Abas metodes var apvienot vairākus DNS fragmentus vienā gabalā.
- Šīs metodes izmanto mērķa vektorus.
- Abās metodēs vairāku DNS fragmentu montāžai tiek izmantoti termiskie cikli.
- Tos tiek izmantotas vietējai mutaģenēzei.
Atšķirība starp Golden Gate un Gibson Assembly
Golden Gate ir molekulārā klonēšanas metode, ko izmanto vairāku DNS fragmentu salikšanai vienā gabalā, pamatojoties uz restrikcijas vietu klātbūtni noteiktā klonējamā secībā, savukārt Gibsona montāža ir molekulārā klonēšanas metode, ko izmanto vairāku DNS fragmentu salikšana vienā gabalā, nepaļaujoties uz restrikcijas vietu klātbūtni noteiktā klonējamā secībā. Šī ir galvenā atšķirība starp Golden Gate un Gibson Assembly. Turklāt Golden Gate metode izmanto apļveida galamērķa vektoru, savukārt Gibsona montāžas metode izmanto linearizētu galamērķu vektoru.
Šajā infografikā parādīta atšķirība starp Golden Gate un Gibson Assembly.
Kopsavilkums - Golden Gate vs Gibson asambleja
Molekulārā klonēšana ir metode, ko izmanto, lai apkopotu rekombinantās DNS molekulas un vadītu to replikāciju saimniekorganismos. Golden Gate un Gibson Assembly ir divas molekulārās klonēšanas metodes, kas ļauj apvienot vairākus DNS fragmentus vienā gabalā. Golden Gate metode balstās uz restrikcijas vietu klātbūtni noteiktā klonējamā secībā, savukārt Gibson Assembly nepaļaujas uz restrikcijas vietu klātbūtni noteiktā klonējamā secībā. Tādējādi šī ir galvenā atšķirība starp Golden Gate un Gibson Assembly.
