Galvenā atšķirība - staigāšana ar hromosomu pret lēkšanu
Hromosomu staigāšana un hromosomu lēkšana ir divi tehniski rīki, ko izmanto molekulārajā bioloģijā gēnu atrašanai hromosomās un genomu fiziskai kartēšanai. Hromosomu staigāšana ir metode, ko izmanto, lai klonētu mērķa gēnu genoma bibliotēkā, atkārtoti izolējot un klonējot blakus esošos genoma bibliotēkas klonus. Hromosomu lēkšana ir īpaša hromosomu staigāšanas versija, kas pārvar hromosomu staigāšanas pārtraukuma punktus. Hromosomu staigāšana var secināt un kartēt tikai nelielus hromosomu garumus, savukārt hromosomu lēkšana ļauj secināt lielas hromosomu daļas. Šī ir galvenā atšķirība starp staigāšanu pa hromosomu un lēkšanu pa hromosomām.
Kas ir staigāšana ar hromosomu?
Hromosomu staigāšana ir rīks, kas pēta hromosomu nezināmo secību reģionus, izmantojot pārklājošus restrikcijas fragmentus. Hromosomu staigāšanā zināma gēna daļa tiek izmantota kā zonde un turpinās, raksturojot visu kartējamās vai sekvencējamās hromosomas garumu. Tas iet no marķiera līdz mērķa garumam. Hromosomu staigāšanā katra pārklājošā fragmenta galus izmanto hibridizācijai, lai identificētu nākamo secību.
Zondes sagatavo no klonētas DNS gala daļām, un tās tiek subklonētas. Pēc tam tos izmanto, lai atrastu nākamo fragmentu, kas pārklājas. Visas šīs pārklājošās sekvences tiek izmantotas, lai izveidotu hromosomas ģenētisko karti un atrastu mērķa gēnus. Tā ir metode garu DNS posmu analīzei, izmantojot nelielus fragmentus, kas pārklājas no rekonstruētās genoma bibliotēkas.
Hromosomu staigāšanas tehnika - soļi
- DNS fragmenta izolēšana, kas satur zināmo gēnu vai marķieri mērķa gēna tuvumā
- Atlasītā fragmenta ierobežojuma kartes sagatavošana un fragmenta beigu apgabala subklonēšana, lai to izmantotu kā zondi
- Zondes hibridizācija ar nākamo pārklājošo fragmentu
- 1. fragmenta restrikcijas kartes sagatavošana un 1. fragmenta beigu apgabala subklonēšana, lai to izmantotu kā zondi nākamā fragmenta, kas pārklājas, identificēšanai.
- Zondes hibridizācija ar nākamo pārklājošo fragmentu 2
-
2. fragmenta restrikcijas kartes sagatavošana un 2. fragmenta beigu apgabala subklonēšana, lai kalpotu par zondi nākamā fragmenta, kas pārklājas, identificēšanai
Iepriekš minētās darbības jāturpina līdz mērķa gēnam vai līdz 3' beigām no sekvences kopējā garuma.
01. attēls: hromosomu staigāšanas tehnika
Hromosomu staigāšana ir svarīgs citoģenētiskais aspekts, lai atrastu daudzu organismu SNP un analizētu ģenētiski transmisīvās slimības un atrastu attiecīgo gēnu mutācijas.
Kas ir hromosomu lēkšana?
Hromosomu lēkšana ir paņēmiens, ko molekulārajā bioloģijā izmanto organismu genomu fiziskai kartēšanai. Šis paņēmiens tika ieviests, lai pārvarētu hromosomu staigāšanas barjeru, kas radās, konstatējot atkārtotus DNS reģionus klonēšanas procesa laikā. Tāpēc hromosomu lēkšanas tehniku var uzskatīt par īpašu hromosomu staigāšanas versiju. Tā ir ātra metode salīdzinājumā ar staigāšanu hromosomās un ļauj apiet atkārtotas DNS sekvences, kuras nav pakļautas klonēšanai hromosomu staigāšanas laikā. Hromosomu lēkšana samazina plaisu starp mērķa gēnu un pieejamajiem zināmajiem marķieriem genoma kartēšanai.
Hromosomu lēciena rīks sākas ar konkrētas DNS griešanu ar īpašām restrikcijas endonukleāzēm un fragmentu ligēšanu cirkulārās cilpās. Tad cirkulāro cilpu secībai tiek izmantots gruntējums, kas izveidots no zināmas secības. Šis primer ļauj lēkt un secināt alternatīvā veidā. Tādējādi tas var apiet atkārtotās DNS sekvences un ātri iziet cauri hromosomām, lai meklētu mērķa gēnu.
Cistiskās fibrozes slimību kodējošā gēna atklāšana tika veikta, izmantojot hromosomu lēkšanas rīku. Kombinācijā hromosomu lēkšana un staigāšana var uzlabot genoma kartēšanas procesu.
2. attēls: hromosomu lēkšana
Kāda ir atšķirība starp staigāšanu ar hromosomu un lēkšanu?
Hromosomu staigāšana pret lēkšanu |
|
| Hromosoma ir rīks, ko molekulārajā bioloģijā izmanto genoma kartēšanai un konkrētu gēnu atrašanās vietas noteikšanai. | Hromosomu lēciens ir rīks, ko izmanto genomu fiziskai kartēšanai un ātrai mērķa gēnu atrašanai hromosomās. |
| Sekvences salīdzinošie garumi | |
| Tikai mazus fragmentus var klonēt ar hromosomu staigāšanu. | Lielākus hromosomu garumus var kartēt ar hromosomu lēcienu. |
| Atkārtotas DNS klonēšana hromosomās | |
| Hromosomu staigāšanas tehnikai ir grūtības staigāt cauri atkārtotām DNS sekvencēm, kas atrodamas hromosomās. | Tas ļauj apiet atkārtotas DNS sekvences. Tāpēc nav nekādu grūtību tos atrast secības noteikšanas laikā. |
| Procesus ietekmējošie faktori | |
| Procesa panākumi ir atkarīgi no genoma lieluma un attāluma, kas “jānostaigā” no zināmas genoma pozīcijas līdz vajadzīgajam gēnam. | Panākumi nav atkarīgi no genoma lieluma attālumā no marķiera līdz mērķim. |
| Neklonētas DNS sekas | |
| Hromosomu staigāšanu var apturēt neklonēti DNS fragmenti. | Zemākās notis pikolo, ko var atskaņot, ir D4. |
| Nepieciešama zināma secība | |
| Process sākas ar zināmu gēnu mērķa tuvumā. | Šajā procesā ir nepieciešams zināms fragments grunts noformēšanai. |
Kopsavilkums - staigāšana ar hromosomu pret lēkšanu
Hromosomu staigāšana tiek izmantota bieži, ja ir zināms, ka konkrēts gēns atrodas netālu no iepriekš klonēta gēna hromosomā, un to ir iespējams identificēt, atkārtoti izolējot blakus esošos genoma klonus no genoma bibliotēkas. Tomēr, ja hromosomu staigāšanas tehnikas laikā tiek atrasti atkārtoti DNS reģioni, procesu nevar turpināt. Līdz ar to tehnika no šī punkta pārtrauc. Hromosomu lēciens ir molekulāri bioloģisks rīks, kas pārvar šo ierobežojumu genomu kartēšanai. Tas apiet šos atkārtotos DNS reģionus, kurus ir grūti klonēt, un palīdz fiziski kartēt genomus. Šī ir galvenā atšķirība starp staigāšanu ar hromosomu un lēkšanu.
