Galvenā atšķirība - SDS lapa pret vietējo lapu
SDS un vietējā lapa ir divu veidu poliakrilamīda gēla elektroforēzes metodes, ko izmanto molekulārajā bioloģijā. Galvenā atšķirība starp SDS lapu un sākotnējo lapu ir izmantotā poliakrilamīda gēla veids. SDS lapā tiek izmantots denaturējošs gēls, tāpēc molekulas tiek atdalītas, pamatojoties uz to molekulmasu. Turpretim Native Page tiek izmantoti nedenaturējoši gēli. Tāpēc molekulas tiek atdalītas, pamatojoties uz to izmēru, lādiņu un formu.
Poliakrilamīda gēla elektroforēzē (Page) izmanto želeju, kas iegūta, polimerizējot akrilamīda monomērus ar metilēnbisakrilamīdu. Poliakrilamīds ir izturīgāks un karstumizturīgāks nekā agaroze. Poliakrilamīda gēliem ir mazāks poru izmērs, kas ļauj efektīvi atdalīt olb altumvielas. Ir divi galvenie lapu iestatījumu veidi, proti, SDS lapa un vietējā lapa. SDS Page vai nātrija dodecilsulfāta poliakrilamīda gēla elektroforēze atdala olb altumvielas, pamatojoties uz to molekulmasu. SDS lapā tiek izmantoti denaturējoši gēli. Vietējā lapa izmanto nedenaturējošus gēlus un atdala olb altumvielas, pamatojoties uz to izmēru, lādiņu un formu (3D konformācija).
Kas ir SDS lapa?
SDS lapa ir visizplatītākā elektroforēzes metode, ko izmanto proteīnu atdalīšanai, pamatojoties uz to molekulmasu. Gelu veido, pievienojot SDS (Sodium dodecil sulfate), kas ir mazgāšanas līdzeklis. SDS proteīnus veido monomēros. SDS ir anjonu mazgāšanas līdzeklis. Tāpēc tas pievieno neto negatīvu lādiņu proteīniem plašā pH diapazonā. Kad olb altumvielu molekulām tiek piešķirts tīrais negatīvais lādiņš, lādiņa izmaiņu dēļ sarežģītās struktūras tiek sadalītas. Negatīvā lādiņa dēļ proteīni piesaista pozitīvā gala virzienā. Tādējādi molekulas ar mazāku molekulmasu ātrāk pārvietojas pa gēla matricu un var tikt novērotas tuvu anodam, turpretim proteīni ar lielāku molekulmasu tiek novēroti tuvāk iedobēm.
Attēls 01: SDS lapa
SDS saistīšanās ar polipeptīdu ķēdi ir proporcionāla tās relatīvajai molekulmasai. Tāpēc molekulmasu var noteikt arī, izmantojot SDS lapu. SDS Page želeju krāsošana tiek veikta ar bromfenolzilo krāsošanu. SDS lapu pielietojums ir plašāks, ja to var izmantot, lai novērtētu relatīvo molekulmasu un noteiktu olb altumvielu relatīvo daudzumu olb altumvielu maisījumā. SDS lapu var izmantot arī, lai noteiktu olb altumvielu sadalījumu olb altumvielu maisījumā. SDS lapa tiek izmantota arī proteīnu attīrīšanai un novērtēšanai. To izmanto kā sākotnējo procedūru Western blotēšanai un hibridizācijai, ko savukārt izmanto proteīnu kartēšanai un identificēšanai.
Kas ir vietējā lapa?
Vietējā poliakrilamīda gēla elektroforēze (Native Page) izmanto nedenaturējošu gēlu. Tāpēc SDS vai kāds cits denaturējošs līdzeklis netiek pievienots gēla matricai. Vietnē Native Page proteīnu atdalīšanas pamatā ir proteīna lādiņš un izmērs. Tāpēc proteīna mobilitāte ir atkarīga no lādiņa un proteīna lieluma.
Proteīna lādiņš ir atkarīgs no aminoskābju sānu ķēdēm. Ja sānu ķēdes ir negatīvi uzlādētas, proteīns saņems vispārēju negatīvu lādiņu un otrādi. Olb altumvielas saglabā 3D konformāciju notiekošās locīšanas dēļ. Salocīšana rodas no vairākiem proteīnu saišu veidiem, piemēram, disulfīda saitēm, hidrofobām mijiedarbībām un ūdeņraža saitēm. Tāpēc, ja vietējā lapa tiek pārvadāta ar neitrālu pH līmeni, olb altumvielas tiks atdalītas atbilstoši proteīna molekulārajai formai. Tāpēc Native Page var izmantot kā jutīgu metodi, lai noteiktu proteīna lādiņa vai konformācijas izmaiņas.
Galvenā vietējās lapas priekšrocība ir tā, ka lapas analīzei izmantoto proteīnu var atgūt sākotnējā stāvoklī pēc lapas analīzes, jo olb altumviela procesa laikā netiek traucēta. Vietējā lapa ir salīdzinoši augstas caurlaidspējas paņēmiens, un tiek palielināta proteīna stabilitāte.
2. attēls: vietējā lapa
Pēc gēla darbības pabeigšanas Native Page gelu var apskatīt, krāsojot ar bromfenolzilo vai jebkuru citu piemērotu krāsošanas reaģentu. Native Page lietojumi ietver skābo proteīnu, tostarp glikoproteīnu, piemēram, cilvēka rekombinantā eritropoetīna, atdalīšanu vai liellopu seruma albumīnā (BSA) esošo proteīnu identificēšanu.
Kādas ir līdzības starp SDS lapu un vietējo lapu?
- Gan SDS Page, gan Native Page sistēmās kā gela matrica tiek izmantots poliakrilamīda gēls.
- Abus izmanto proteīnu atdalīšanai un identificēšanai.
- Abi izmanto elektroforēzes mobilitāti, lai atdalītu savienojumus.
- Abus var veikt vertikāli vai horizontāli (galvenokārt tiek veikti kā vertikāli lapas iestatījumi, jo darbības garums ir lielāks).
- Abu metožu darbībai ir nepieciešams elektroforēzes aparāts, tostarp gēla tvertne, ķemmes, barošanas avots.
- Gela vizualizāciju var veikt ar krāsošanas metodēm abās tehnikās.
Kāda ir atšķirība starp SDS lapu un vietējo lapu?
SDS lapa pret vietējo lapu |
|
| SDS lapa vai nātrija dodecilsulfāta lapa atdala olb altumvielas, pamatojoties uz to molekulmasu, un tajā izmanto denaturējošu želeju. | Native Page izmanto nedenaturējošus gēlus un atdala olb altumvielas, pamatojoties uz to izmēru, lādiņu un formu (3D konformācija). |
| Gēla veids | |
| SDS lapā tiek izmantots denaturējošs gēls. | Vietējā lapā tiek izmantots nedenaturējošs gēls. |
| SDS klātbūtne | |
| SDS ir kā mazgāšanas līdzeklis, lai radītu negatīvu lādiņu paraugam SDS lapā. | SDS nav vietējā lapā. |
| Atdalīšanas pamats | |
| Olb altumvielu atdalīšana ir atkarīga no proteīna molekulmasas SDS lapā. | Atdalīšana ir atkarīga no proteīna molekulas izmēra un formas sākotnējā lapā. |
| Proteīna stabilitāte | |
| Proteīna stabilitāte SDS lapā ir zema. | Olb altumvielu stabilitāte vietējā lapā ir augsta. |
| Oriģinālā proteīna atgūšana | |
| Nav iespējams, jo tas ir denaturēts SDS lapā. | Iespējams vietējā lapā. |
Kopsavilkums - SDS lapa salīdzinājumā ar vietējo lapu
SDS lapa un vietējā lapa ir divu veidu poliakrilamīda gēla elektroforēzes metodes, ko izmanto proteīnu atdalīšanai. SDS lapa tiek apstrādāta ar mazgāšanas līdzekli, ko sauc par SDS. SDS piešķir proteīnam vispārēju negatīvu lādiņu, kas pēc tam izraisa proteīna denaturāciju. Tāpēc olb altumvielas tiek atdalītas, pamatojoties uz to molekulmasu. Turpretim vietējās lapas tehnikā netiek izmantots neviens denaturējošs līdzeklis. Tādējādi olb altumvielas tiek atdalītas atkarībā no to lieluma vai formas. Šī ir atšķirība starp SDS lapu un vietējo lapu.
