Galvenā atšķirība - siltā un aukstā tripsinizācija
Siltā un aukstā tripsinizācija ir divas metodes, ko izmanto šūnu enzīmu sadalīšanai dzīvnieku šūnu kultivācijā. Galvenā atšķirība starp silto un auksto tripsīnu, kā norāda nosaukumi, ir atkarīga no temperatūras, kurā tripsīns tiek pievienots šūnu sadalīšanai. Siltā tripsinizācija notiek augstākas temperatūras apstākļos (36,5–37 0C), savukārt aukstā tripsinizācija notiek zemas temperatūras apstākļos.
Dzīvnieku šūnu primāro šūnu kultivēšanas procesā tiek izmantotas trīs galvenās metodes, kas ir izrādījušās veiksmīgas. Trīs metodes ietver šūnu mehānisko sadalīšanu, šūnu enzīmu sadalīšanu un primāro eksplantācijas paņēmienu. Šūnu fermentatīvā sadalīšanās, kas izraisa šūnu izolāciju, un to veic proteīnu noārdošais enzīms tripsīns. Tāpēc šis process ir pazīstams kā tripsinizācija. Tripsinizāciju var veikt divos dažādos apstākļos, proti, siltā tripsinizācija un aukstā tripsinizācija. Siltā tripsinizācija ir šūnu apstrādes metode ar tripsīnu siltos apstākļos 36,5-37 0C. Aukstā tripsinizācija ir tripsīna apstrādes process, kas notiek vēsākos apstākļos, vēlams ledus, saglabājot ļoti zemu temperatūru.
Kas ir siltā tripsinizācija?
Tripsinizāciju var veikt, lai sadalītu šūnu komponentus, lai izolētu šūnas, lai iegūtu primāro šūnu kultūru. Tripsīns ir proteīnu sadalīšanās enzīms, un tripsinizācijā izmantotais enzīmu maisījums var būt vai nu neapstrādāts ekstrakts, vai attīrīts produkts. Tiek uzskatīts, ka neapstrādāts ekstrakts ir efektīvāks olb altumvielu lizē un šūnu sadalīšanā, jo tas satur citus noārdošus enzīmus.
Siltā tripsinizācija ir visbiežāk izmantotā fermentatīvā metode šūnu sadalīšanai, kas notiek augstākas temperatūras apstākļos. Pirms apstrādes ar tripsinizāciju vēlamos audus sasmalcina mazākos gabaliņos. Tas atvieglo vienkāršu sadalīšanas procesu. Pēc tam sasmalcinātos audus mazgā īpašā barotnē, kas pazīstama kā Dissection Basal S alt barotne.
Pēc mazgāšanas posma šūnas tiek pārveidotas kolbā, kas satur aktīvo fermentu, kas ir tripsīns. Tā kā šis paņēmiens paredz siltu tripsinizācijas protokolu, tripsīns tiek novietots apmēram 37 0C temperatūrā apmēram četras stundas.
01. attēls: tripsīns
Saturs tiek sajaukts un maisīts, izmantojot centrifugēšanas metodes, lai atvieglotu protokolu un paātrinātu sadalīšanas procesu. Kad ir sasniegts ieteicamais laiks, šūnas var iegūt no supernatanta. Šūnas, kas iegūtas no supernatanta, pēc tam inkubē noteiktā temperatūrā un laikā.
Kas ir aukstā tripsinizācija?
Aukstā tripsinizācija ir cits tripsinizācijas veids, kas notiek aukstos apstākļos. Šajā tehnikā šūnas, kas tiek sasmalcinātas un mazgātas, ievieto flakonos uz ledus un pēc tam iemērc ar tripsīnu. Mērcēšanas periods ir daudz ilgāks – apmēram 6 – 24 stundas.
Pēc mērcēšanas procedūras pabeigšanas tripsīns tiek izņemts no šūnu lizāta, un audu gabalus tālāk inkubē 37 0C temperatūrā apmēram 20–30 minūtes. Šūnu dezagregāciju izraisa atkārtota audu maisījuma pipete. Tas ļaus šūnām atdalīties no membrānas un nonākt supernatantā. Kad šūnas atrodas supernatantā, tās inkubē un audzē vēlamajā temperatūrā un laika periodā.
Aukstajai tripsinizācijas metodei ir vairākas priekšrocības
- Lielāks dzīvotspējīgo šūnu daudzums, jo tiek samazināts šūnu bojājums. Šūnu bojājumi tiek samazināti, neizmantojot centrifugēšanas darbības.
- Ļoti ērta metode.
- Mazāk darbietilpīgs.
Aukstās tripsinizācijas metodes galvenais ierobežojums ir tāds, ka lielus daudzumus nevar izmantot vienā gadījumā.
Kādas ir līdzības starp silto un auksto tripsinizāciju?
- Gan siltā, gan aukstā tripsinizācijas procesos šūnu sadalīšanai izmanto enzīmu tripsīnu.
- Šūnu dezagregācijas procedūrās tiek izmantoti gan siltā, gan aukstā tripsinizācijas procesi.
- Gan siltās, gan aukstās tripsinizācijas procedūrās šūnas tiek iegūtas no supernatanta.
Kāda ir atšķirība starp siltu un aukstu tripsinizāciju?
Silta pret aukstu tripsinizāciju |
|
| Siltā tripsinizācija ir metode šūnu apstrādei ar tripsīnu siltos apstākļos 36,5 – 37 °C temperatūrā 0. | Aukstā tripsinizācija ir tripsīna apstrādes process, kas notiek vēsākos apstākļos, vēlams ledus, saglabājot ļoti zemu temperatūru. |
| Protokols | |
| Sasmalcinātie audu gabali tiek uzturēti 37 0C temperatūrā nepārtraukti visas procedūras laikā. | Sasmalcinātus audu gabalus sākotnēji uztur ledusaukstā temperatūrā un pēc tam uztur 37 0. |
| Temperatūra | |
| Silta tripsinizācija notiek pie 36,5–37 0 | Aukstā tripsinizācija notiek ledus aukstā temperatūrā. |
| Patērētais laiks | |
| Visam siltās tripsinizācijas procesam nepieciešams mazāks laiks (apmēram 4 stundas). | Nepieciešams ilgāks laiks (apmēram 6–24 stundas) aukstai tripsinizācijai. |
| Dzīvotspējīgo šūnu raža | |
| Zems siltās tripsinizācijas līmenis. | Aukstā tripsinizācija. |
| Centrifugēšanas izmantošana | |
| Centrifugēšana ir nepieciešama šūnu sadalīšanai siltā tripsīnizācijā. | Centrifugēšana nav nepieciešama aukstā tripsinizācijā. |
| Sākotnējais audu daudzums tripsinizācijai | |
| Siltā tripsinizācijā var izmantot lielāku audu daudzumu. | Aukstā tripsinizācijā var izmantot mazāku audu daudzumu. |
| Šūnu bojājumi | |
| Augsti, pateicoties centrifugēšanai siltā tripsinizācijā. | Mazāk aukstās tripsinizācijas dēļ. |
Kopsavilkums - siltā vai aukstā tripsinizācija
Tripsinizācija ir proteīnu noārdošā enzīma tripsīna izmantošanas metode primāro šūnu kultūru sadalīšanai un sagatavošanai šūnu kultivēšanas procesā. Ir divi galvenie tripsinizācijas paņēmieni, kuru pamatā ir procedūras laikā izmantotā temperatūra. Tie ir siltā un aukstā tripsinizācija. Siltu tripsinizāciju veic 37 0C temperatūrā, turpretim auksto tripsinizāciju veic ledus aukstos apstākļos. Lai gan aukstās tripsinizācijas pabeigšana prasa ilgāku laiku, tiek teikts, ka tajā ir lielāks dzīvotspējīgo šūnu daudzums. Tas ir saistīts ar faktu, ka aukstā tripsīnizācijā šūnu bojājumi tiek samazināti līdz minimumam, jo netiek izmantotas enerģiskas centrifugēšanas darbības. Šī ir atšķirība starp siltu un aukstu tripsinizāciju.
