Galvenā atšķirība - neass pret lipīgo galu
Restrikcijas endonukleāzes ir specifiski fermenti, kas sagriež divpavedienu DNS (dsDNS). Molekulārajā bioloģijā tās ir pazīstamas arī kā molekulārās šķēres. Restrikcijas enzīmi spēj atpazīt specifiskas īsas dsDNS sekvences, kas pazīstamas kā atpazīšanas vietas, un sašķelt fosfodiestera un ūdeņraža saites, lai atvērtu dubultās virknes. Šo enzīmu šķelšanas rezultātā tiek iegūti DNS fragmenti ar dažāda veida galiem, piemēram, lipīgiem un neasiem galiem. DNS ligāze ir enzīms, ko izmanto molekulārajā bioloģijā, lai savienotu divas blakus esošās DNS virknes, veidojot jaunas saites. Solis ir pazīstams kā nosiešana, un atkarībā no ligētā DNS gala veida to var saukt par neaso galu nosiešanu un lipīgo galu nosiešanu. Galvenā atšķirība starp neaso un lipīgo galu nosiešanu ir tāda, ka strupā gala nosiešana notiek starp DNS fragmentiem, kuriem ir divi neasi gali, turpretī lipīgā gala nosiešana notiek starp 5’ un 3’ pārkarēm. Salīdzinot ar neaso galu nosiešanu, lipīgā gala nosiešana ir efektīvāka un stabilāka.
Kas ir neasa gala saite?
Dažas restrikcijas endonukleāzes var sagriezt DNS pretējās bāzēs un radīt neasus galu DNS fragmentus. Šie fermenti ir pazīstami kā neaso galu griezēji; tie sašķeļ taisni uz leju līdz restrikcijas vietas vidum, neatstājot viengabalainas pārkarenas pamatnes. Strupus galus sauc arī par nepārkarošiem galiem, jo to galos nav 3’ un 5’ nokarenu pamatņu. Abas šķipsnas beidzas no bāzes pāriem neasos galos. Parastie strupo galu griešanas fermenti ir EcoRV HaeIII, AluI un SmaI.
Neaso galu nosiešana ir iesaistīta starp diviem neasiem galiem. Tā nav izvirzītu pamatu nosiešana. Šī nosiešana ir mazāk efektīva nekā lipīgā gala nosiešana. Tomēr dažos gadījumos neaso galu nosiešana kļūst izdevīgāka par lipīgo galu nosiešanu, īpaši, ja tiek ligoti PCR produkti. PCR produkti vienmēr tiek ražoti ar neasiem galiem. Strupo galu nosiešanai nav nepieciešami komplementāri DNS gali.
Attēls 01: Neass rezultāts ar Eco RV fermentu
Kas ir lipīgā gala saite?
Dažas restrikcijas endonukleāzes spēj sagriezt dsDNS, beigās atstājot pārkarenu vienpavedienu DNS gabalu. Šie gali ir pazīstami kā lipīgi vai nokareni gali. Lipīgo galu nosiešana notiek starp diviem DNS fragmentiem, kuriem ir atbilstošas pārkares, jo lipīgajos galos ir nesapārotas bāzes, un, lai izveidotu saites, ir nepieciešamas komplementāras bāzes. Tāpēc ir nepieciešams izmantot vienu un to pašu restrikcijas enzīmu abiem DNS avotiem, lai iegūtu atbilstošus ligācijas fragmentus.
Lipīgā gala nosiešana ir efektīvāka un bieži vien ir ļoti vēlama klonēšanas procesos. Ir vairāki restrikcijas enzīmi, kas rada lipīgus galus. Tie ir EcoRI, BamHI, HindIII utt.
Attēls 02: lipīga gala ražošana, izmantojot Eco RI fermentu
Kāda ir atšķirība starp Blunt un Sticky End Ligation?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| Trupā gala nosiešana notiek starp diviem neaso galu DNS fragmentiem. | Lipīga gala nosiešana notiek starp diviem atbilstošiem DNS fragmentiem ar lipīgiem galiem. |
| Enzīmi | |
| Neaso galu griezēji rada neasus galus. | Lipīgo galu griezēji rada lipīgus vai saliedētus galus. |
| Prasība pēc atbilstības beigām | |
| Tam nav nepieciešami atbilstoši fragmenti vai papildinošas bāzes. | Lai veidotu bāzu pārus, galos ir nepieciešamas papildu bāzes. |
| Efficiency | |
| Tā ir mazāk efektīva nekā lipīgā gala nosiešana | Tas ir efektīvāks par strupu galu nosiešanu. |
Kopsavilkums - Blunt vs Sticky End ligation
Restrikcijas endonukleāzes spēj šķelt dsDNS un ražot DNS fragmentus ar dažādiem galiem. Viņi atpazīst noteiktas sekvences un ierobežo DNS, radot lipīgus un neasus galus. Lipīgajiem galiem fragmentu galā ir nesapārotas pamatnes. Neasi gali veidojas taisnas šķelšanās dēļ, un to galos ir bāzes pāri. Lipīga gala ligāšanai nepieciešami divi komplementāri vienpavediena DNS gabali. Strupā gala nosiešana notiek starp jebkuriem diviem neaso galu fragmentiem. Šī ir atšķirība starp neaso un lipīgo nosiešanu.
