Galvenā atšķirība - gēnu klonēšana pret PCR
Daudzu DNS kopiju sintēzi no konkrēta DNS fragmenta sauc par DNS pastiprināšanu. Ir divi galvenie DNS amplifikācijas procesi, proti, gēnu klonēšana un PCR. Galvenā atšķirība starp gēnu klonēšanu un PCR ir tāda, ka gēnu klonēšana rada vairākas konkrēta gēna kopijas in vivo, konstruējot rekombinanto DNS un augot saimniekbaktērija iekšienē, savukārt PCR ražo miljoniem konkrēta DNS fragmenta kopiju in vitro, veicot atkārtotus denaturācija un sintēze.
Kas ir gēnu klonēšana?
Gēnu klonēšana ir paņēmiens, ko izmanto, lai atrastu un pavairotu konkrētu gēnu no ekstrahētās organisma genoma DNS, konstruējot rekombinanto DNS. Genomiskā DNS satur tūkstošiem dažādu gēnu, kas kodēti proteīniem. Kad DNS tiek ekstrahēta, tajā ir iekļauti visi iespējamie gēni, ko tā var nēsāt. Gēnu klonēšanas tehnika ir ļāvusi noteikt konkrētu gēnu no kopējās DNS. Tāpēc gēnu klonēšana kalpo kā svarīgs instruments molekulārajā bioloģijā.
Organisma genoma bibliotēkas izveide ir būtiska gēnu klonēšanā, ja nav ne jausmas par attiecīgā gēna atrašanās vietu DNS. Genomiska bibliotēka tiek izveidota, izmantojot šādas darbības.
1. darbība: kopējās DNS ekstrakcija no organisma, kas satur vajadzīgo gēnu.
2. darbība. Ekstrahētās DNS šķelšanas ierobežošana, lai iegūtu mazus pārvaldāmus fragmentus. Šo soli atvieglo restrikcijas endonukleāzes.
3. solis: Piemērota vektora atlase un vektora DNS atvēršana, izmantojot tās pašas restrikcijas endonukleāzes. Baktēriju plazmīdas parasti izmanto kā vektorus svešas DNS pārnēsāšanai. Plazmīdas ir mazi DNS apļi, kas atrodas baktērijās.
4. darbība: vektora DNS un fragmentētās DNS apvienošana, lai iegūtu rekombinanto DNS molekulu. Šo soli regulē DNS ligāze.
5. darbība. Rekombinantās DNS molekulu pārnešana saimniekbaktērijās. Šo darbību sauc par pārveidošanu, un to veic, izmantojot karstuma šoku.
5. darbība. Transformēto baktēriju šūnu skrīnings barotnē. Transformācijas procesa beigās tiek iegūta jaukta transformētu un netransformētu saimniekšūnu populācija. Interesējošais gēns ietver tikai transformētās saimniekšūnās. Tāpēc ir nepieciešams atlasīt pārveidotās šūnas. Atlase tiek veikta, izmantojot selektīvus barotnes, kas satur antibiotikas. Šajā skrīninga vidē aug tikai pārveidotās šūnas, kas ļauj veikt atlasi.
6. darbība: baktēriju audzēšana, lai izveidotu gēnu bibliotēku. Šajā posmā transformētās saimniekšūnas ievada svaigā barotnē, kas nodrošina optimālas augšanas prasības. Kopējās kolonijas kultūras plāksnēs atspoguļo šī organisma genoma bibliotēku.
7. darbība. Rekombinantās DNS molekula, kas satur interesējošo gēnu, ir jāpārbauda no tūkstošiem klonētu rekombinantās DNS fragmentu. To var panākt, izmantojot zondes, kas iezīmē konkrēto gēnu vai specifisko proteīnu, kas izriet no šī gēna.
Kad no kopējām kolonijām ir identificēts ieinteresētais gēns, kas satur baktēriju koloniju, ir iespējams izveidot miljoniem rekombinantās plazmīdas kopiju, kas satur gēnu.
Gēnu klonēšana tiek izmantota gēnu bibliotēku izveidošanai, īpašu proteīnu, vitamīnu, antibiotiku, hormonu ražošanai, organismu genomu sekvencēšanai un kartēšanai, vairāku indivīdu DNS kopiju izgatavošanai kriminālistikā utt.
Attēls_1: Gēnu klonēšana
Kas ir PCR?
Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir metode, kas ģenerē lielu skaitu konkrēta DNS fragmenta kopiju. Konkrētas DNS sekvences eksponenciālu pastiprināšanu iegūst ar PCR in vitro apstākļos. Šis paņēmiens ir ļoti spēcīgs rīks molekulārajā bioloģijā, jo tas var pavairot nelielu DNS paraugu izmantojamā daudzumā. PCR ieviesa Karijs Mulliss 1983. gadā, un šis godalgotais izgudrojums radīja milzīgu progresu molekulārajā bioloģijā.
PCR tehnika seko atkārtotām PCR reakcijām, kā parādīts 02. attēlā. Viena PCR reakcija sastāv no trim galvenajiem posmiem, kas notiek trīs dažādās temperatūrās; divpavedienu denaturēšana pie DNS 94 0C, praimeru atkausēšana pie 68 0C un virknes pagarināšana pie 72 0 C. Tāpēc, veicot PCR, temperatūras svārstības ir ļoti jāsaglabā pareizai replikācijai. PCR veic PCR iekārtā PCR mēģenēs. PCR mēģenēs tiek ievietoti pareizi PCR maisījumi, kas satur šablona DNS, Taq polimerāzi, primerus, dNTP un buferi. Divpavedienu parauga DNS denaturēšana vienpavedienu DNS tiek veikta, pārtraucot ūdeņraža saites starp komplementārām bāzēm 94–98 0C temperatūrā. Pēc tam atsevišķas veidnes DNS virknes tiek pakļautas primeriem. Jānodrošina pāris gruntskrāsu (uz priekšu un atpakaļ), un tiem jābūt termostabiliem, lai izturētu augstu temperatūru. Praimeri ir vienas virknes īsas DNS sekvences, kas papildina mērķa DNS fragmenta galus. PCR izmanto sintētiskos praimerus. Praimeri saistās ar parauga DNS komplementārajām bāzēm un ierosina jaunas virknes sintēzi. Šo soli katalizē enzīms, ko sauc par Taq polimerāzi; termostabils DNS polimerāzes enzīms, kas izolēts no Thermus auqaticus. Kad ir pieejami primeri un nukleotīdi (būvbloki), Taq polimerāze konstruē jaunu DNS virkni, kas ir komplementāra DNS šablonam. PCR programmas beigās tiek novērots pastiprināts DNS fragments, izmantojot gēla elektroforēzi. Ja nepieciešama turpmāka analīze, PCR produkts tiek attīrīts no gēla.
PCR ir ļoti noderīga ģenētisko un iegūto slimību diagnosticēšanai un uzraudzībai, noziedznieku identificēšanai (tiesu medicīnas jomā), mērķtiecīga DNS segmenta struktūras un funkciju izpētei, organismu genomu sekvencēšanai un kartēšanai, utt. PCR ir kļuvusi par parastu laboratorijas paņēmienu medicīnas un molekulārās bioloģijas pētniecības laboratorijās zinātnieku vidū, jo tai ir plašs lietojumu klāsts.
Attēls_2: Polimerāzes ķēdes reakcija
Kāda ir atšķirība starp gēnu klonēšanu un PCR?
Gēnu klonēšana pret PCR |
|
| Gēnu klonēšana ir process, kurā tiek izveidotas vairākas noteikta gēna kopijas in vivo, izmantojot rekombinanto DNS un pārveidojot par saimniekbaktēriju. | PCR tehnika rada vairākas noteiktas DNS sekvences kopijas in vitro, izmantojot atkārtotus PCR reakciju ciklus. |
| Rekombinantās DNS konstruēšanas prasība | |
| Rekombinantā DNS tiek ražota, lai noteiktu gēnu. | Rekombinantā DNS netiek ražota. |
| Nepieciešams darbaspēks | |
| Šis process ir darbietilpīgs. | Intensīvs darbs nav vajadzīgs. |
| In vivo vai In vitro process | |
| Rekombinantās DNS konstruēšana notiek in vitro un DNS amplifikācija notiek in vivo. | DNS amplifikācija notiek pilnīgi in vitro. |
Kopsavilkums - gēnu klonēšana pret PCR
Gēnu klonēšana un PCR ir divas metodes, ko izmanto DNS amplifikācijai. PCR ir in vitro process, kurā tiek izgatavotas vairākas konkrēta DNS fragmenta DNS kopijas, neizmantojot rekombinanto DNS un saimniekorganismu. Gēnu klonēšana galvenokārt ir in vivo process, kura rezultātā saimniekorganismā tiek izveidotas vairākas ieinteresētā gēna kopijas, veidojot rekombinanto DNS. Šī ir atšķirība starp gēnu klonēšanu un PCR.
