Galvenā atšķirība starp sekvencēšanu pēc klona pēc klona un bises sekvencēšanu slēpjas to uzvedības metodēs. Klonēšana pēc klona sekvencēšanas metodes ietver hromosomu kartēšanu un klonēšanu pirms sekvencēšanas, savukārt klonēšana ar bises sekvencēšanu sekvencēšanas laikā izlaiž gan hromosomu kartēšanu, gan klonēšanas posmus.
Klonēšana ar klonu sekvencēšanu un klonēšana, izmantojot bise, ir divas mūsdienu genoma sekvencēšanas metodes. Klonēšana pēc klona sekvencēšanas ir uzticamāka sekvencēšanas metode. Tomēr klonēšanas metode ar bises sekvencēšanu ir ātrāka un lētāka. Rakstā galvenā uzmanība pievērsta smalkajai atšķirībai starp sekvencēšanu pēc klona un bises sekvencēšanu.
Kas ir Klonēšana pēc klona secības?
Klonēšana ar klonu sekvencēšanu ir genoma sekvencēšanas metode. Tas prasa katras hromosomas kartēšanu pirms DNS sadalīšanas. Pēc kartēšanas DNS jāsadala 150 kilobāzes garos fragmentos. Pēc tam šie fragmenti ir gatavi secībai. Nākamais solis ir DNS fragmentu ievietošana baktēriju mākslīgajās hromosomās (BAC) un pēc tam baktēriju šūnās. Tā kā fragmenti tagad atrodas baktēriju šūnās, katru reizi, kad baktērijas dalās, arī ievietotie DNS fragmenti sadalās un rada daudzas identiskas kopijas. Pēc tam atsevišķā baktēriju klona DNS tiek fragmentēta 500 bāzes pāru garos fragmentos. Tie ir mazāki fragmenti, kas pārklājas. Tālāk sekvencēšana notiek, ievietojot šos fragmentus vektorā ar zināmu DNS secību. Sākot no zināmās vektora secības, sekvencēšana turpinās līdz nezināmai secībai.
Pēc secības pabeigšanas ir nepieciešams identificēt secību pārklājošās zonas. Pēc tam notiek fragmentu savienošana, veidojot lielākus fragmentus, kas sākotnēji tika parādīti BAC. Tālāk lielāku fragmentu salikšana hromosomā notiek saskaņā ar genoma karti.
Attēls 01: Klonēšana pēc klona secības
Nozīmīgā klonēšanas ar klonu sekvencēšanas priekšrocība ir tā, ka iepriekš sagatavotā genoma karte palīdz uzticami apkopot lielākus fragmentus. Taču šīs sekvencēšanas metodes trūkums ir tāds, ka genoma karšu ģenerēšana un klonu veidošana ir laikietilpīga. Tomēr šī metode tika dota priekšroka “Cilvēka genoma projekta” laikā.
Kas ir Clone by Shotgun Sequencing?
Klonēšana ar bises sekvencēšanu ir sekvencēšanas metode, kas nejauši sadala DNS sekvences daudzos mazos fragmentos un no jauna saliek secību, novērojot pārklājošos reģionus. Lielākus zīdītāju genomus ir grūti klonēt un salikt. Tas ir saistīts ar to struktūras sarežģītību un lielumu. Lai gan klons pēc klonu sekvencēšanas metodes ir uzticams, sarežģītu organismu genomu sekvencēšana prasa ilgu laiku. Tāpēc klonēšana ar bises sekvencēšanu ir kļuvusi par uzticamu un lētāku sekvencēšanas metodi, ko var veikt ātrāk. Tāpēc mūsdienu zinātnieki paļaujas uz šo sekvencēšanas metodi, lai risinātu sarežģītus genomus.
2. attēls: klonēšana ar bises sekvencēšanu
Klonēšanas laikā, izmantojot bises sekvencēšanas metodi, netiek veiktas tradicionālas genoma kartēšanas un klonēšanas darbības. Sākotnēji viss genoms ir sadalīts dažādos izmēros no 20 kilobāzēm līdz 300 kilobāzēm. Tālāk notiek secība. Pēc tam, izmantojot sarežģītu datorprogrammu, ir nepieciešams salikt fragmentus, aplūkojot pārklājošos reģionus.
Klonēšana ar bises sekvencēšanu palīdz uzlabot esošo genoma secību precizitāti. Šīs metodes galvenā priekšrocība ir tā, ka tā ir daudz ātrāka un lētāka nekā klonēšanas pēc klona sekvencēšanas metode. Tomēr šis process neietver ģenētiskās kartes izmantošanu. Tādējādi kļūdu iespējamība montāžas laikā ir lielāka. Tādējādi tas ir būtisks trūkums klonēšanā ar bises sekvencēšanas metodi.
Kādas ir līdzības starp sekvencēšanu pēc klona un bises sekvencēšanu?
- Gan klonēšana pēc klona sekvencēšanas, gan bises sekvencēšana ir divas genoma sekvencēšanas metodes.
- Abu secības metožu laikā sadalīto fragmentu apkopošana notiek, identificējot pārklājošos reģionus.
- Arī DNS sadalīšana mazākos fragmentos ir nepieciešama gan klonu, gan bises sekvencēšanai.
Kāda ir atšķirība starp sekvencēšanu pēc klona un bises sekvencēšanu?
Klonēšana ar klonu sekvencēšanas paņēmienu ietver divus galvenos posmus: hromosomu kartēšanu un klonēšanu. Turpretim klonēšana ar bises sekvencēšanu neievēro šīs divas darbības; tas nejauši sadala DNS sekvences daudzos mazos fragmentos un atkal saliek secību, novērojot pārklājošos reģionus. Tādējādi šī ir galvenā atšķirība starp sekvencēšanu pēc klona un bises sekvencēšanu. Šī faktora dēļ sekvencēšana pēc klona ir dārgs un laikietilpīgs process, savukārt klonēšana ar bise ir ātrāka un lētāka.
Tomēr kļūdu rašanās montāžas laikā ir mazāka iespējamība, ka klonēšanas ar klonu secības laikā rodas kļūdas. Tādējādi tam ir augsta uzticamība. Tomēr klonēšana ar bises sekvencēšanu ir salīdzinoši mazāk uzticams paņēmiens. Tātad šī ir arī būtiska atšķirība starp sekvencēšanu pēc klona un bises sekvencēšanu.
Tālāk esošajā informācijas grafikā ir sniegta plašāka informācija par atšķirību starp sekvencēšanu pēc klona un bises sekvencēšanu.
Kopsavilkums - Klonu secība pēc klona pret bises sekvencēšanu
Apkopojot atšķirību starp klonu sekvencēšanu ar klonu un bises sekvencēšanu, klons pēc klona sekvencēšanas un bises sekvencēšana ir divas genoma sekvencēšanas metodes. Tomēr klonēšana pēc klona sekvencēšanas paņēmieniem ietver gan genoma kartēšanas, gan klonēšanas procesus, savukārt klonēšana ar bises sekvencēšanu to nedara. Tātad, šī ir galvenā atšķirība starp sekvencēšanu pēc klona un bises sekvencēšanu. Tā kā genoma kartēšana notiek klonēšanas laikā ar klonu sekvencēšanu, kļūdu iespējamība ir mazāka sekvenču montāžas laikā. Bet klonēšana ar bises sekvencēšanu ir daudz ātrāks un lētāks process. Tomēr tas ir salīdzinoši mazāk uzticams. Klonēšana ar klonu sekvencēšanu bija vēlamā sekvencēšanas metode “Cilvēka genoma projekta” laikā. Taču mūsdienu molekulārais biologs vairāk paļaujas uz klonu ar bises sekvencēšanu.
