Galvenā atšķirība - PCR primeri un sekvencēšanas primeri
Pateicoties jaunākajiem sasniegumiem molekulārās bioloģijas jomā, tika izstrādātas dažādas ģenētiskās metodes, kas atviegloja un ļāva izmeklēt dažādus tēmas virzienus. PCR un citas sekvencēšanas procedūras ir divas svarīgas šādas metodes. Viņi izmanto dažādas apakškomponentes. Praimeri tiek uzskatīti par galveno apakškomponentu, kas kopīgs gan PCR, gan sekvencēšanas metodēm. PCR praimeri tiek izmantoti noteiktas DNS sekvences amplifikācijai, savukārt sekvencēšanas praimeri tiek izmantoti DNS fragmenta sekvencēšanas kontekstā ar nolūku atklāt tā īpašo nukleotīdu secības secību. Šī ir galvenā atšķirība starp PCR primeriem un sekvencēšanas primeriem.
Kas ir PCR primeri?
Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir ģenētiska metode, ko izmanto molekulārās bioloģijas jomā, lai pastiprinātu vienu vai dažas konkrēta DNS segmenta kopijas un iegūtu daudzus miljonus identisku kopiju. PCR reakcijā tiek izmantoti dažādi komponenti, ieskaitot praimerus. Praimeri ir īsas DNS virknes ar 18–25 nukleotīdu garumu, kas padara tos saderīgus ar pastiprināmo DNS fragmentu sākuma un beigu reģionu. Primers var būt uz priekšu grunts un reverse grunts. Šie praimeri saistās ar DNS fragmentu noteiktos punktos, kur tas liek DNS polimerāzei saistīties ar specifisko primeru attiecīgajā vietā un ierosina jaunās DNS virknes sintēzi.
Primeru izvēle ir svarīgs PCR procesa aspekts. Svarīga ir gruntskrāsas garuma izvēle. Ideāls garums būtu 18-25 nukleotīdi. Ja garums ir pārāk īss vai pārāk garš, praimeri nesaistīsies ar DNS secību, lai to varētu precīzi pavairot. Ja primeri ir pārāk īsi, dažādās DNS sekvences vietās notiek nespecifiska primera atkausēšana.
Attēls 01: PCR primeri
Guanīna un citozīna (GC) saturam labā gruntē ir jābūt diapazonā no 40 līdz 60. Praimera atkausēšanas temperatūra un kušanas temperatūra ir būtiski faktori PCR laikā. Kušanas temperatūra jāaprēķina precīzi, un grunts atkausēšanas temperatūrai jābūt par 5 0C zemākai par kušanas temperatūru. Kušanas temperatūrai jābūt 60 °C un 75 °C. Pārāk augsta vai pārāk zema temperatūra izraisīs mazāk aktīvu DNS polimerāzes aktivitāti.
Kas ir secības primeri?
Sekvencēšanas praimerus izmanto DNS fragmenta sekvencēšanas kontekstā ar nolūku atklāt tā īpašo identitāti. Lai iegūtu labus sekvencēšanas rezultātus, svarīgi ir augstas kvalitātes primeri un veidnes. Tādējādi, atlasot primerus, tiem jābūt unikāliem konkrētam reģionam, kurā mēs vēlamies sekvencēt. Tam jābūt arī ar pareizu orientāciju, kur secības parasti tiek ģenerētas no primeru 3' līdz 5' galiem. Secībai nevajadzētu būt nevēlamai pašhibridizācijai, piemēram, matadata cilpu veidošanai. Tas nedrīkst saturēt secīgu guanīna bāzu veidošanos.
Gruntējuma kušanas temperatūrai (Tm) jābūt piemērotai sekvencēšanas apstākļiem. Tāpēc tam vajadzētu būt no 52oC līdz 74oC. Oligonukleotīdu sagatavošana, lai tos izmantotu kā praimeri, ir jāattīra, lai iegūtu vēlamo secības pilno garumu. Ja oligonukleotīdi satur piemaisījumus, praimeru secības signāli tiks uzlikti no dažādām primēšanas vietām, un tas arī samazinās bāzes šūnu skaitu.
2. attēls: Primeru secības noteikšana
Oligonukleotīda praimera kušanas temperatūra (Tm) nosaka, cik spēcīgi komplementārie DNS pavedieni ir savstarpēji hibridizēti. Tm var uzskatīt par termodinamisku aprēķinu, kur tas ir atkarīgs gan no DNS sekvencēm, gan no vairākiem apstākļiem, piemēram, sāls koncentrācijas. Tm ir svarīgs PCR laikā, kur variants, ko sauc par cikla sekvencēšanu, tiek izmantots, lai iegūtu dideoksinukleotīdu terminētu fragmentu grupu. Šeit sekvencētais praimeris sākotnēji tiks alternatīvi atkvēlināts, pēc tam pagarināts un visbeidzot denaturēts amplifikācijai. Tāpēc Tm vērtībai jābūt robežās no 52oC līdz 74o C. Sintezētos oligonukleotīdus var iegūt DNS/RNS sintēzes laboratorijās saskaņā ar izvēle. Nelielais sintēzes apjoms, ko izmanto DNS sekvencēšanai, parasti ir 50 nmol. Vissvarīgākais ir arī tas, ka sekvencēšanai izmantotie grunti ir jāattīra, lai tajos nebūtu piemaisījumu, kas neļaus pazemināt kvalitāti.
Kādas ir līdzības starp PCR primeriem un sekvencēšanas primeriem?
- Gan PCR primeri, gan sekvencēšanas primeri ir primeri, ko izmanto mērķtiecīgas DNS sekvences amplifikācijas procesā.
- Gan PCR primeri, gan sekvencēšanas primeri sastāv no nukleotīdiem.
- Gan PCR primeri, gan sekvencēšanas primeri ir īsi oligomēri.
Kāda ir atšķirība starp PCR primeriem un sekvencēšanas primeriem?
PCR primers pret sekvencēšanas primeriem |
|
| PCR praimeri ir īsas DNS virknes ar nukleotīdu secības garumu 18–25, kas padara tos saderīgus ar pastiprināmo DNS fragmentu sākuma un beigu reģionu. | Sekvencēšanas primeri ir īsi oligomēri, kurus izmanto DNS fragmenta sekvencēšanas kontekstā ar nolūku atklāt tā specifisko identitāti. |
| Funkcija | |
| PCR praimeri tiek izmantoti noteiktas DNS sekvences amplifikācijai. | Sekvencēšanas primerus izmanto DNS fragmenta sekvencēšanas kontekstā ar nolūku atklāt tā īpašo identitāti. |
| Nepieciešamo primeru skaits | |
| Divi grunti; kā PCR primers tiek izmantots viens priekšējais primer un viens reversais primers. | Kā sekvencēšanas grunts ir nepieciešams tikai viens gruntējums. |
Kopsavilkums - PCR primeri pret sekvencēšanas primeriem
Sekvencēšanas praimerus izmanto DNS fragmenta sekvencēšanas kontekstā ar nolūku atklāt tā īpašo identitāti. Procesa palaišanai pietiks ar vienu secības grunti. Lai iegūtu labus sekvencēšanas rezultātus, svarīgi ir augstas kvalitātes grunti un veidnes. Tādējādi, izvēloties primerus, tiem jābūt unikāliem konkrētam reģionam, kurā mēs vēlamies veikt sekvences. PCR primeri ir īsas DNS virknes ar 18–25 nukleotīdu garumu, kas ir saderīgs ar pastiprināmo DNS fragmentu sākuma un beigu reģionu. PCR primeri var būt tiešā un reversā primeri. Guanīna un citozīna (GC) saturam labā gruntē jābūt diapazonā no 40 līdz 60. Praimera atkausēšanas temperatūra un kušanas temperatūra ir būtiski aspekti PCR laikā. Šī ir atšķirība starp PCR primeriem un sekvencēšanas primeriem.
