Galvenā atšķirība - RT PCR pret QPCR
Polimerāzes ķēdes reakcija ir metode, ko izmanto, lai pastiprinātu noteiktu DNS reģionu in vitro. Pateicoties Karija Mullisa šīs tehnikas izgudrojumam 1983. gadā, zinātnieki pētniecības nolūkos spēj izgatavot no tūkstošiem līdz miljoniem konkrētu DNS fragmentu kopiju. Pašlaik tā ir kļuvusi par izplatītu un regulāri izmantotu paņēmienu klīniskajās un pētniecības laboratorijās dažādiem lietojumiem. Pastāv tradicionālo PCR tehnikas variācijas, piemēram, RT PCR, ligzdoto PCR, multiplekso PCR, Q PCR, RT – QPCR utt. RT PCR un Q PCR ir divas svarīgas PCR variācijas. Galvenā atšķirība starp RT PCR un Q PCR ir tāda, ka RT PCR izmanto, lai noteiktu gēnu ekspresiju, izveidojot komplementārus DNS (cDNS) transkriptus no RNS, savukārt Q PCR izmanto, lai kvantitatīvi izmērītu PCR produktus reāllaikā, izmantojot fluorescējošas krāsvielas.
Kas ir RT PCR?
Reversās transkripcijas polimerāzes ķēdes reakcija (RT PCR) ir PCR variants, ko izmanto, lai noteiktu RNS ekspresiju. Tā ir ļoti svarīga metode mRNS ekspresijas noteikšanai audos. RT PCR izmanto, ja parauga izejmateriāls ir RNS. RT PCR veidnes mRNS vispirms pārvērš komplementārā DNS. Šo soli katalizē enzīms reversā transkriptāze, un process ir pazīstams kā reversā transkripcija. Otrkārt, nesen sintezētās cDNS amplifikācijai izmanto tradicionālo PCR.
RT PCR ir ļoti jutīga metode, kurai nepieciešams salīdzinoši neliels RNS parauga daudzums. RT PCR parasti izmanto RNS sugu, īpaši RNS vīrusu, piemēram, cilvēka imūndeficīta vīrusa un C hepatīta vīrusa, diagnosticēšanai un kvantitatīvai noteikšanai.
Attēls 01: RT PCR tehnika
Kas ir QPCR?
Kvantitatīvā PCR (QPCR) ir PCR variants, ko izmanto, lai kvantitatīvi izmērītu PCR produktus. To sauc arī par reāllaika polimerāzes ķēdes reakciju, jo tā mēra reāllaika pastiprināšanos, izmantojot reālā laika PCR iekārtu. Tā ir piemērota metode, lai noteiktu paraugā esošās mērķa sekvences vai gēna daudzumu. Interesanta QPCR iezīme ir tā, ka tā apvieno gan pastiprināšanu, gan patieso kvantitatīvo noteikšanu vienā solī. Tāpēc vajadzību pēc gēla elektroforēzes noteikšanā var novērst, izmantojot QPCR metodi. QPCR izmanto fluorescējošas krāsvielas, lai marķētu PCR produktus PCR reakciju laikā, kas galu galā noved pie tiešas kvantitatīvās noteikšanas. Kad PCR produkti uzkrājas, tiek uzkrāti arī fluorescējošie signāli, un tos mērīs reālā laika mašīna. QPCR var kombinēt ar RT PCR. Tā ir pazīstama kā RT – QPCR vai QRT – PCR un tiek uzskatīta par jaudīgāko, jutīgāko un kvantitatīvāko metodi RNS līmeņa noteikšanai šūnās vai audos.
SYBR Green un Taqman ir divas metodes, ko izmanto, lai noteiktu vai skatītu reāllaika PCR pastiprināšanas procesu. SYBR Green metode tiek veikta, izmantojot fluorescējošu krāsu, ko sauc par SYBR green, un nosaka amplifikāciju, saistot krāsu, veidojot divpavedienu DNS. Taqman tiek veikts, izmantojot divkārši marķētas zondes un nosaka pastiprināšanos, zondi sadalot ar Taq polimerāzi un fluorofora izdalīšanos, kā parādīts 02. attēlā. Abas metodes uzrauga amplifikācijas procesa gaitu un ziņo par produkta daudzumu reāllaikā..
Reālā laika PCR ir plašs lietojumu klāsts, piemēram, gēnu ekspresijas kvantitatīva noteikšana, mikroRNS un nekodējošas RNS analīze, SNP genotipēšana, kopiju skaita variantu noteikšana, retu mutāciju noteikšana, ģenētiski modificētu organismu noteikšana, infekcijas izraisītāju noteikšana. utt.
Attēls 02: Kvantitatīvā PCR tehnika
Kāda ir atšķirība starp RT PCR un QPCR?
RT PCR pret QPCR |
|
| RT PCR ir paņēmiens, ko izmanto, lai noteiktu gēnu ekspresiju ar amplifikāciju. | QPCR ir paņēmiens, kas pastiprina DNS un kvantitatīvi nosaka PCR produktus reāllaikā. |
| Reversās transkriptāzes enzīma iesaistīšanās | |
| RT PCR izmanto fermentu reverso transkriptāzi. | QPCR neizmanto fermentu reverso transkriptāzi. |
| Fluorescējoši marķētu molekulu izmantošana | |
| Fluorescējoši marķētas krāsvielas vai zondes netiek izmantotas RT PCR. | QPCR tiek izmantotas fluorescējoši marķētas krāsvielas vai zondes. |
| PCR produkta kvantitatīvā noteikšana | |
| Ja vien tas nav savienots ar QPCR, RT PCR nenosaka PCR produkta daudzumu. | QPCR kvantitatīvi mēra PCR produktu. |
| Sākuma materiāls | |
| Izejas materiāls ir mRNS. | Izejas materiāls ir DNS. |
| cDNS sintēze | |
| RT PCR laikā tiek ražota komplementāra DNS. | QPCR laikā netiek ražota komplementāra DNS. |
Kopsavilkums - RT PCR pret QPCR
RT PCR un QPCR ir divas tradicionālās PCR versijas. RT PCR tehnika tiek veikta mRNS paraugiem, un to virza reversā transkripcija un cDNS ražošana. QPCR izmanto, lai kvantitatīvi noteiktu PCR produktus reālā laika PCR termisko ciklu laikā, izmantojot fluorescējošas krāsvielas vai marķētas zondes. QPCR PCR produkta daudzumu attēlo parauga emitētie fluorescējošie signāli. RT PCR plaši izmanto kā amplifikācijas procesu, savukārt QPCR parasti izmanto kā kvantitatīvas noteikšanas procesu. Šī ir atšķirība starp RT PCR un QPCR.
