Galvenā atšķirība - Maksims Gilberts vs Sangera sekvencēšana
Nukleotīdi ir DNS pamatstruktūrvienības un celtniecības bloki. DNS molekula sastāv no polinukleotīdu ķēdes. DNS ir atrodami četri dažādi nukleotīdi. Šie nukleotīdi sastāv no četrām dažādām slāpekļa bāzēm, ko sauc par A (adenīns), G (guanīns), C (citozīns), T (timīns). Nukleotīdu secībai DNS molekulā ir liela nozīme, jo tā kodē svarīgu ģenētisko informāciju organismu augšanai un attīstībai. DNS sekvencēšana attiecas uz procesu, kas nosaka precīzu DNS nukleotīdu secību. Ir dažādas DNS sekvencēšanas metodes. Maksama Gilberta sekvencēšana un Sangera DNS sekvencēšana ir divas DNS sekvencēšanas metodes, kas pieder pie pirmās paaudzes sekvencēšanas. Maksima Gilberta sekvencēšanas procedūra nosaka bāzes secību, ķīmiski sadalot 5' gala marķētos DNS fragmentus, galvenokārt katrā no četriem nukleotīdiem un gēla elektroforēzi. Sangera sekvencēšanas procedūra nosaka nukleotīdu secību, sintezējot vienpavedienu DNS, izmantojot DNS polimerāzi un didezoksinukleotīdus un gēla elektroforēzi. Šī ir galvenā atšķirība starp Maksimu Gilbertu un Sangera sekvencēšanu.
Kas ir Maksama Gilberta sekvencēšana?
Maksama Gilberta sekvencēšana, kas pazīstama arī kā ķīmiskās sekvencēšanas metode, ir metode, kas izstrādāta, lai noteiktu nukleotīdu secību DNS. Šo metodi 1976. gadā ieviesa V alters Gilberts un Alans Maksams, un tā kļuva populāra, jo to var veikt tieši ar attīrītu DNS. Maksama Gilberta metode pieder pie pirmās paaudzes DNS sekvencēšanas, un tā bija pirmā zinātnieku plaši izmantotā sekvencēšanas metode.
Šīs metodes pamatprincips ir ierobežot iezīmēto DNS fragmentu skaitu noteiktās bāzēs ar bāzei specifiskām ķīmiskām vielām un apstākļiem un iezīmēto fragmentu atdalīšanu ar elektroforēzi, kā parādīts 01. attēlā. Fragmenti tiek atdalīti saskaņā ar to izmēriem uz želejas. Tā kā fragmenti ir marķēti, DNS molekulas secību var viegli secināt.
Maksama Gilberta metode izmanto bāzes specifiskas ķīmiskas vielas, lai sadalītu DNS noteiktās bāzēs. Lai selektīvi ietekmētu purīnus un pirimidīnus, tiek izmantotas divas izplatītas ķīmiskas vielas, ko sauc par dimetilsulfātu un hidrazīnu.
Maksima Gilberta sekvencēšanas metode tiek veikta, izmantojot vairākas šādas darbības.
- DNS sekvences attīrīšana, izmantojot restrikcijas endonukleāzes
- DNS fragmentu galu marķēšana, pievienojot radioaktīvos fosfātus
- Marķēto fragmentu attīrīšana no nemarķētiem fragmentiem ar gēla elektroforēzi
- Gala iezīmētās DNS atdalīšana četrās mēģenēs un apstrāde ar bāzei specifiskām ķīmiskām vielām atsevišķi
- Katras mēģenes satura elektroforēze uz atsevišķām līnijām uz gēla un fragmentu atdalīšana atbilstoši to garumam.
- Fragmentu noteikšana ar autoradiogrāfu.
Attēls 01: Maksima Gilberta secība
Kas ir Sangera sekvencēšana?
Sangera sekvencēšana ir secības noteikšanas metode, ko 1977. gadā izstrādāja Frederiks Sangers un viņa kolēģi, lai noteiktu konkrēta DNS fragmenta bāzes secību. To sauc arī par ķēdes pārtraukšanas sekvencēšanu vai Dideoxy sekvencēšanas metodi. Šī metode darbojas pēc ķēdes beigu dideoksinukleotīdu (ddNTP), piemēram, ddGTP, ddCTP, ddATP un ddTTP, selektīvas iekļaušanas ar DNS polimerāzi vienas virknes DNS sintēzes laikā, lai pārtrauktu virknes veidošanos. Dideoksinukleotīdiem trūkst 3’ OH grupu, lai veidotu fosfodiestera saites ar blakus esošo nukleotīdu. Līdz ar to šķipsnu veidošanās apstājas, tiklīdz ddNTP tiek iekļauts jaunizveidotajā virknē sangera sekvencēšanas laikā.
Šajā metodē četrās atsevišķās mēģenēs ar viena veida ddNTP tiek veiktas četras atsevišķas DNS sintēzes reakcijas (PCR). PCR caurulēm tiek piegādātas arī citas prasības, tostarp praimeri, dNTP, Taq polimerāze, īpaši apstākļi utt. Četras atsevišķas reakcijas tiek veiktas četrās mēģenēs ar četriem maisījumiem. Pēc PCR reakcijām iegūtie DNS fragmenti tiek termiski denaturēti un atdalīti ar gēla elektroforēzi. Pēc tam fragmentus vizualizē, izmantojot marķētu (radioaktīvu vai fluorescējošu) primeru vai dNTP, kā parādīts 02. attēlā.
2. attēls: Sangera secība
Kāda ir atšķirība starp Maxam Gilbert un Sanger Sequencing?
Maksams Gilberts vs Sangera sekvencēšana |
|
| Maksima Gilberta sekvencēšana ir pirmā metode, kas izstrādāta DNS sekvencēšanai. | Sangera sekvencēšanas metode tika ieviesta pēc Maksama Gilberta sekvencēšanas metodes. |
| Lietošana | |
| Šo metodi izmanto reti. | Sekvences noteikšanai regulāri tiek izmantota Sangera sekvencēšana. |
| Bīstamu ķīmisko vielu lietošana | |
| Tajā izmanto bīstamas ķīmiskas vielas. | Bīstamu ķīmisko vielu izmantošana ir ierobežota salīdzinājumā ar Maksama Gilberta metodi. |
| Marķēšana noteikšanai | |
| Šajā metodē DNS fragmentu galu marķēšanai izmanto radioaktīvo P32. | Sangera sekvencēšanā tiek izmantoti radioaktīvi vai fluorescējoši marķēti ddNTP. |
Kopsavilkums - Maksims Gilberts vs Sangera sekvencēšana
Maksima Gilberta un Sangera sekvencēšana ir divu veidu DNS sekvencēšanas paņēmieni, uz kuriem attiecas pirmās paaudzes DNS sekvencēšana. Maksama Gilberta sekvencēšana ir pirmā metode, kas tika ieviesta DNS sekvencēšanai 1976. gadā, un tā tiek veikta, sadalot gala marķētos DNS fragmentus ar bāzei specifiskām ķīmiskām vielām. Tāpēc to sauc par ķīmisko secību. Sangera sekvencēšanas metode tika ieviesta 1977. gadā, un tās pamatā ir ddNTP vadītas ķēdes pārtraukšanas reakcijas. Sangera sekvencēšanas metode ir populāra nekā Maksama Gilberta metode, pateicoties vairākiem Maxam Gilbert metodes trūkumiem, piemēram, pārmērīgam laika patēriņam, bīstamu ķīmisko vielu izmantošanai utt. Šī ir atšķirība starp Maksama Gilberta un Sangera sekvencēšanu.
