Galvenā atšķirība - NGS vs Sangera sekvencēšana
Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS) un Sangera sekvencēšana ir divu veidu nukleotīdu sekvencēšanas metodes, kas izstrādātas laika gaitā. Sangera sekvencēšanas metode tika plaši izmantota daudzus gadus, un NGS nesen to aizstāja tās priekšrocību dēļ. Galvenā atšķirība starp NGS un Sangera sekvencēšanu ir tāda, ka NGS darbojas pēc principa, ātri secinot miljoniem secību vienlaikus, izmantojot sekvencēšanas sistēmu, savukārt Sangera sekvencēšana darbojas pēc ķēdes pārtraukšanas principa, jo DNS polimerāzes enzīms selektīvi iekļauj dideoksinukleotīdus. DNS replikācijas laikā un rezultātā fragmentu atdalīšana ar kapilāro elektroforēzi.
Kas ir nukleotīdu sekvencēšana?
Ģenētiskā informācija tiek glabāta organisma DNS vai RNS nukleotīdu sekvencēs. Pareizas nukleotīdu secības noteikšanas process (izmantojot četras bāzes) noteiktā fragmentā (gēnā, gēnu klasterī, hromosomā un pilnajā genomā) ir pazīstams kā nukleotīdu sekvencēšana. Gēnu struktūras un funkcijas analīze ir ļoti svarīga genomikas pētījumos, tiesu medicīnas pētījumos, virusoloģijā, bioloģiskajā sistemātikā, medicīniskajā diagnostikā, biotehnoloģijā un daudzās citās jomās. Zinātnieki ir izstrādājuši dažādu veidu sekvencēšanas metodes. Tostarp Frederika Sangera 1977. gadā izstrādātā Sangera sekvencēšana tika plaši izmantota un popularizēta ilgu laiku, līdz to aizstāja nākamās paaudzes sekvencēšana.
Kas ir NGS?
Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS) ir termins, ko lieto, lai apzīmētu mūsdienu augstas veiktspējas sekvencēšanas procesus. Tajā ir aprakstītas vairākas dažādas mūsdienu sekvencēšanas tehnoloģijas, kas radīja revolūciju genoma pētījumos un molekulārajā bioloģijā. Šīs metodes ir Illumina sekvencēšana, Roche 454 sekvencēšana, jonu protonu sekvencēšana un SOLiD (sekvencēšana, izmantojot Oligo Ligation Detection) sekvencēšana. NGS sistēmas ir ātrākas un lētākas. NGS sistēmās tiek izmantotas četras galvenās DNS sekvencēšanas metodes, proti; pirosekvencēšana, sekvencēšana ar sintēzi, sekvencēšana ar ligāciju un jonu pusvadītāju sekvencēšana. Paralēli var sekvencēt lielu skaitu DNS vai RNS virkņu (miljoniem). Tas nodrošina visa organismu genoma sekvencēšanu īsā laika periodā, atšķirībā no Sangera sekvencēšanas, kas aizņem vairāk laika.
NGS ir daudz priekšrocību salīdzinājumā ar parasto Sangera sekvencēšanas metodi. Tas ir ātrdarbīgs, precīzāks un izmaksu ziņā izdevīgāks process, ko var veikt ar nelielu paraugu. NGS var izmantot metagenomiskos pētījumos, lai noteiktu variācijas atsevišķā genomā, ko izraisa ievietošana un dzēšana utt., un gēnu ekspresiju analīzē.
Attēls_1: NGS sekvencēšanas attīstība
Kas ir Sangera sekvencēšana?
Sangera sekvencēšana ir secības noteikšanas metode, ko 1977. gadā izstrādāja Frederiks Sangers un viņa kolēģi, lai noteiktu konkrēta DNS fragmenta precīzu nukleotīdu secību. To sauc arī par ķēdes pārtraukšanas sekvencēšanu vai dideoksi sekvencēšanu. Šīs metodes darbības princips ir virknes sintēzes pārtraukšana, DNS replikācijas laikā selektīvi iekļaujot ķēdi noslēdzošos dideoksinukleotīdus (ddNTP), piemēram, ddGTP, ddCTP, ddATP un ddTTP. Normālos nukleotīdos ir 3’ OH grupas, lai izveidotu fosfodiestera saiti starp blakus esošajiem nukleotīdiem, lai turpinātu virknes veidošanos. Tomēr ddNTP trūkst šīs 3' OH grupas, un tie nespēj veidot fosfodiestera saites starp nukleotīdiem. Tādējādi ķēdes pagarinājums ir pārtraukts.
Šajā metodē sekvencējamā vienpavediena DNS kalpo par veidnes virkni DNS sintēzei in vitro. Citas prasības ir oligonukleotīdu primer, deoksinukleotīdu prekursori un DNS polimerāzes enzīms. Ja ir zināmi mērķa fragmenta blakus esošie gali, primerus var viegli izveidot DNS replikācijai. Četrās atsevišķās mēģenēs tiek veiktas četras atsevišķas DNS sintēzes reakcijas. Katrai caurulei ir atsevišķi ddNTP, kā arī citas prasības. No konkrētā nukleotīda pievieno dNTP un ddNTP maisījumu. Tāpat četrās mēģenēs ar četriem maisījumiem tiek veiktas četras atsevišķas reakcijas. Pēc reakcijām tiek veikta DNS fragmentu noteikšana un fragmentu raksta pārvēršana sekvences informācijā. Iegūtos DNS fragmentus termiski denaturē un atdala ar gēla elektroforēzi. Ja tiek izmantoti radioaktīvie nukleotīdi, joslu zīmējumu poliakrilamīda gēlā var vizualizēt ar autoradiogrāfiju. Ja šajā metodē tiek izmantoti fluorescējoši marķēti didezoksinukleotīdi, to var mazināt gēla nolasīšanas laikā un izlaist cauri lāzera staram, ko nosaka fluorescējošais detektors. Lai izvairītos no kļūdām, kas var rasties, ja secību nolasa ar aci un manuāli ievada datorā, šī metode tika izstrādāta, lai izmantotu automatizētu sekvencētāju kopā ar datoru.
Šī ir metode, ko izmanto cilvēka genoma projekta DNS sekvencēšanai. Šī metode joprojām tiek izmantota ar uzlabotām modifikācijām, jo tā sniedz precīzu informāciju par secību, neskatoties uz to, ka process ir dārgs un lēns.
Attēls_2: Sangera secība
Kāda ir atšķirība starp NGS un Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Nākamās paaudzes sekvencēšana (NGS) attiecas uz mūsdienu augstas caurlaidspējas sekvencēšanas procesiem. Tajā ir aprakstītas vairākas dažādas mūsdienu sekvencēšanas tehnoloģijas | Sangera sekvencēšana ir Frederika Sangera izstrādāta sekvencēšanas metode, lai noteiktu konkrēta DNS fragmenta precīzu nukleotīdu secību. |
| Izmaksu efektivitāte | |
| NGS ir lētāks process, jo tas samazina laiku, cilvēka spēku un ķīmiskās vielas. | Tas ir dārgs process, jo tas prasa laiku, cilvēka spēku un vairāk ķīmisku vielu. |
| Ātrums | |
| Tas ir ātrāks, jo gan ķīmiskā noteikšana, gan signālu noteikšana daudzās daļās notiek paralēli. | Tas ir laikietilpīgs, jo ķīmiskā noteikšana un signāla noteikšana notiek kā divi atsevišķi procesi un vienlaikus var nolasīt tikai daļu. |
| Uzticamība | |
| NGS ir uzticams. | Sangera sekvencēšana ir mazāk uzticama |
| Parauga izmērs | |
| NGS prasa mazāku DNS daudzumu. | Šai metodei nepieciešams liels daudzums DNS veidnes. |
| DNS bāzes uz secīgu fragmentu | |
| DNS bāzu skaits sekvencētam fragmentam ir mazāks nekā Sangera metode | Sekvenču ģenerēšana ir garāka nekā NGS sekvences. |
Kopsavilkums - NGS vs Sangera secība
NGS un Sangera sekvencēšana ir nukleotīdu sekvencēšanas metodes, ko plaši izmanto molekulārajā bioloģijā. Sangera sekvencēšana ir agrīna sekvencēšanas metode, kas tika aizstāta ar NGS. Galvenā atšķirība starp NGS un Sangera sekvencēšanu ir tā, ka NGS ir ātrdarbīgs, precīzāks un izmaksu ziņā efektīvāks process nekā Sangera sekvencēšana. Abas metodes radīja lielus uzliesmojumus ģenētikā un biotehnoloģijā.
