Galvenā atšķirība - Sangera sekvencēšana pret pirosekvencēšanu
DNS sekvencēšana ir ļoti svarīga DNS analīzei, jo zināšanas par pareizo nukleotīdu izvietojumu noteiktā DNS reģionā atklāj daudz svarīgas informācijas par to. Ir dažādas DNS sekvencēšanas metodes. Sangera sekvencēšana un pirosekvencēšana ir divas dažādas DNS sekvencēšanas metodes, ko plaši izmanto molekulārajā bioloģijā. Galvenā atšķirība starp Sangera sekvencēšanu un pirozes noteikšanu ir tāda, ka Sangera sekvencēšana izmanto dideoksinukleotīdus, lai pārtrauktu DNS sintēzi, lai nolasītu nukleotīdu secību, savukārt pirosekvencēšana nosaka pirofosfāta izdalīšanos, iekļaujot nukleotīdus un sintezējot komplementāro secību, lai nolasītu precīzu secības secību.
Kas ir Sangera sekvencēšana?
Sangera sekvencēšana ir pirmās paaudzes DNS sekvencēšanas metode, ko 1977. gadā izstrādāja Frederiks Sangers un viņa koledžas. Tā ir pazīstama arī kā ķēdes pārtraukšanas sekvencēšana vai dideoksisekvencēšana, jo tās pamatā ir ķēdes pārtraukšana ar dideoksinukleotīdiem (ddNTP). Šī metode tika plaši izmantota vairāk nekā 30 gadus, līdz tika izstrādāta jaunās paaudzes sekvencēšana (NGS). Sangera sekvencēšanas tehnika ļāva atklāt pareizo nukleotīdu secību vai pievienot konkrētu DNS fragmentu. Tā pamatā ir selektīva ddNTP iekļaušana un DNS sintēzes pārtraukšana in vitro DNS replikācijas laikā. 3' OH grupu trūkums, lai turpinātu fosfodiestera saites veidošanos starp blakus esošajiem nukleotīdiem, ir unikāla ddNTP iezīme. Tādējādi, tiklīdz ddNTP ir pievienots, ķēdes pagarinājums beidzas un beidzas no šī punkta. Sangera sekvencēšanā tiek izmantoti četri ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP un ddTTP. Šie nukleotīdi aptur DNS replikācijas procesu, kad tie tiek iekļauti augošajā DNS virknē un rada dažāda garuma īsu DNS. Kapilārā gēla elektroforēzi izmanto, lai sakārtotu šīs īsās DNS virknes pēc to izmēriem uz gēla, kā parādīts 01. attēlā.
1. attēls: sintezētas īsās DNS kapilārā gēla elektroforēze
DNS replikācijai in vitro ir jāsniedz dažas prasības. Tie ir DNS polimerāzes enzīms, veidnes DNS, oligonukleotīdu primeri un deoksinukleotīdi (dNTP). Sangera sekvencēšanā DNS replikāciju veic četrās atsevišķās mēģenēs kopā ar četru veidu ddNTP atsevišķi. Dezoksinukleotīdi nav pilnībā aizstāti ar attiecīgajiem ddNTP. Konkrētā dNTP maisījums (piemēram, dATP + ddATP) tiek iekļauts mēģenē un tiek atkārtots. Četrus atsevišķus mēģenes produktus palaiž uz želejas četrās atsevišķās iedobēs. Pēc tam, nolasot želeju, secību var izveidot, kā parādīts 02. attēlā.
2. attēls: Sangera secība
Sangera sekvencēšana ir svarīgs paņēmiens, kas palīdz daudzās molekulārās bioloģijas jomās. Cilvēka genoma projekts tika veiksmīgi pabeigts, izmantojot Sangera sekvencēšanas metodes. Sangera sekvencēšana ir noderīga arī mērķa DNS sekvencēšanai, vēža un ģenētisko slimību izpētē, gēnu ekspresijas analīzē, cilvēka identificēšanā, patogēnu noteikšanā, mikrobu sekvencēšanā utt.
Sangera sekvencēšanai ir vairāki trūkumi:
- Sekvencējamās DNS garums nedrīkst būt garāks par 1000 bāzes pāriem
- Vienlaikus var sekvencēt tikai vienu daļu.
- Process ir laikietilpīgs un dārgs.
Tāpēc laika gaitā tika izstrādātas jaunas uzlabotas secības noteikšanas metodes, lai pārvarētu šīs problēmas. Tomēr Sangera sekvencēšana joprojām tiek izmantota, jo tās rezultāti ir ļoti precīzi līdz aptuveni 850 bāzes pāru garuma fragmentiem.
Kas ir pirosekvencēšana?
Pirozekvencēšana ir jauna DNS sekvencēšanas metode, kuras pamatā ir "sekvencēšana ar sintēzi". Šī metode balstās uz pirofosfāta izdalīšanās noteikšanu pēc nukleotīda iekļaušanas. Procesu izmanto četri dažādi enzīmi: DNS polimēre, ATP sulfurilāze, luciferāze un apirāze un divi substrāti adenozīna 5' fosfosulfāts (APS) un luciferīns.
Process sākas ar praimera saistīšanos ar vienpavedienu DNS veidni, un DNS polimerāze sāk tai komplementāru nukleotīdu iekļaušanu. Kad nukleotīdi savienojas kopā (nukleīnskābes polimerizācija), tas atbrīvo pirofosfātu (divas fosfātu grupas, kas saistītas kopā) grupas un enerģiju. Katra nukleotīda pievienošana atbrīvo ekvimolāru pirofosfāta daudzumu. Pirofosfāts pārvēršas par ATP ar ATP sulfurilāzes palīdzību substrāta APS klātbūtnē. Radītais ATP veicina luciferāzes izraisītu luciferīna pārvēršanu par oksiluciferīnu, radot redzamu gaismu daudzumos, kas ir proporcionāli ATP daudzumam. Gaismu nosaka fotonu noteikšanas ierīce vai fotopavairotājs un izveido pirogrammu. Apirāze noārda ATP un reakcijas maisījumā neiekļautos dNTP. dNTP pievienošana tiek veikta vienreiz. Tā kā nukleotīda pievienošana ir zināma atbilstoši gaismas iekļaušanai un noteikšanai, var noteikt veidnes secību. Pirogrammu izmanto, lai ģenerētu parauga DNS nukleotīdu secību, kā parādīts 03. attēlā.
Pirozekvencēšana ir ļoti svarīga viena nukleotīda polimorfisma analīzē un īsu DNS posmu sekvencēšanā. Augsta precizitāte, elastība, automatizācijas vienkāršība un paralēlā apstrāde ir pirosekvencēšanas priekšrocības salīdzinājumā ar Sangera sekvencēšanas metodēm.
03. attēls: pirosekvencēšana
Kāda ir atšķirība starp Sanger Sequencing un Pyrosequencing?
Sangera sekvencēšana pret pirosekvencēšanu |
|
| Sangera sekvencēšana ir DNS sekvencēšanas metode, kuras pamatā ir selektīva ddNTP iekļaušana ar DNS polimerāzi un ķēdes pārtraukšanu. | Pirozekvencēšana ir DNS sekvencēšanas metode, kuras pamatā ir pirofosfāta izdalīšanās noteikšana pēc nukleotīda iekļaušanas. |
| DdNTP lietošana | |
| ddNTP tiek izmantoti, lai pārtrauktu DNS replikāciju | ddNTP netiek izmantoti. |
| Iesaistītie enzīmi | |
| Tiek izmantota DNS polimerāze. | Tiek izmantoti četri fermenti: DNS polimerāze, ATP sulfurilāze, luciferāze un apirāze. |
| Izmantotie substrāti | |
| APS un Luciferin netiek lietoti. | Tiek izmantots adenozīna 5’ fosfosulfāts (APS) un luciferīns. |
| Maksimālā temperatūra | |
| Tas ir lēns process. | Šis ir ātrs process. |
Kopsavilkums - Sangera sekvencēšana pret pirosekvencēšanu
Sangera sekvencēšana un Pyrosequencing ir divas DNS sekvencēšanas metodes, ko izmanto molekulārajā bioloģijā. Sangera sekvencēšana konstruē nukleotīdu secību secībā, pārtraucot ķēdes pagarinājumu, savukārt pirosekvencēšana konstruē precīzu nukleotīdu secību secībā, iekļaujot nukleotīdus un nosakot pirofosfātu izdalīšanos. Tāpēc galvenā atšķirība starp Sangera sekvencēšanu un pirozes noteikšanu ir tāda, ka Sangera sekvencēšana darbojas uz sekvencēšanu, pārtraucot ķēdi, savukārt pirosekvencēšana darbojas uz sekvencēšanu, izmantojot sintēzi.
