Galvenā atšķirība - klonēšana pret subklonēšanu
Klonēšana un subklonēšana ir molekulāri bioloģiskas procedūras, kas rada ģenētiski identiskas šūnas vai organismus, kas satur interesējošo DNS vai gēnu. Klonēšana ir metode, kas ietver ieinteresētā gēna vai DNS ievietošanu vektorā, tā replikāciju saimniekbaktērija un šūnu vai organismu ražošanu, kas ir precīzas ģenētiskā sastāva kopijas. Subklonēšana ir paņēmiens, kas ietver interesējošā gēna, kas jau ir ievietots vektorā, ievietošanu sekundārajā vektorā, tā replikāciju saimniekbaktērija un ģenētiski identisku šūnu vai organismu kopiju ražošanu.galvenā atšķirība starp klonēšanu un subklonēšanu ir tāda, ka klonēšanas laikā interesējošais gēns, kas ligēts vektorā, turpina klonēšanas procesu, savukārt subklonēšanas laikā jau klonētais interesējošais gēns tiek atdalīts no sākotnējā vektora un atkal ievietots saņēmēja vektoru un turpiniet procesu.
Kas ir klonēšana?
Klonēšana ir procedūra, kas ražo ģenētiski identiskus organismus vai šūnas. Dabā klonēšana notiek ar aseksuālās pavairošanas līdzekļiem. Ja nav ģenētiskas rekombinācijas vai izmaiņu, meitas šūnas saņem tādu pašu vecāku ģenētisko sastāvu. Prokariotu un eikariotu organismi veido klonus, izmantojot bināro dalīšanos, pumpuru veidošanos, mitozi utt. Molekulārajā bioloģijā gēnu vai specifisku DNS fragmentu klonēšana ir populāra metode konkrētās DNS sekcijas struktūras un funkciju pētīšanai.
Molekulārās klonēšanas galvenais mērķis ir izveidot miljoniem ģenētiski identisku šūnu vai organismu kopiju, kas satur interesējošo DNS fragmentu (galvenokārt gēnus). Tas rada organismus ar precīzām cita ģenētiskām kopijām. Pirmkārt, specifiski gēni tiek klonēti molekulārajos pētījumos, lai iegūtu strukturālu un funkcionālu informāciju un DNS sekvencēšanu. Arī specifisku proteīnu vai produktu ražošanai lielā apjomā klonēšana tiek plaši izmantota.
Klonēšanas procedūra
Klonēšanas procedūras pamatdarbības ir šādas.
- Interesējošā gēna identifikācija un izolēšana. (Interesējošā gēna amplifikācija ar PCR).
- Interesējošā gēna ierobežošana (restrikcijas endonukleāze sagriež gēnu).
- Vektora DNS ierobežošana. (Arī vektora DNS tiek sagriezta, izmantojot to pašu restrikcijas endonukleāzi).
- Gēna ievietošana vektorā un rekombinantās molekulas veidošanās.
- Rekombinantā vektora transformācija saimniekbaktērijā.
- Transformēto baktēriju izolēšana un identifikācija (plazmīda vektoram jāietver selektīvs gēns, visbiežāk antibiotiku rezistences gēns, lai pārmeklētu transformētas baktērijas).
- Rekombinantā gēna ekspresija saimniekdatorā.
Attēls_01: Klonēšanas procedūra
Kas ir subklonēšana?
Subklonēšana ir procedūra interesējošā gēna pārvietošanai no viena vektora uz citu vektoru, lai redzētu gēna ekspresiju un iegūtu vēlamo gēna funkcionalitāti. Šajā metodē ir iesaistīti divi vektori; proti, vecākvektors un galamērķa vektors. Klonētie ieliktņi atkal tiek pārvietoti uz otru subklonēšanas vektoru. Gēnu pārnešanas no pirmā vektora uz otro vektora mērķis ir iegūt kaut ko tādu, ko nevarētu izdarīt pirmais vektors, vai atkal atdalīt gēnu jau klonētajā DNS fragmentā un izteikt to atsevišķi. Šīs procedūras sākumā tiek izmantoti restrikcijas enzīmi.
Subklonēšanas procedūra
Subklonēšanas pamatdarbības ir šādas.
- Ar restrikcijas endonukleāžu palīdzību interesējošās DNS atdalīšana donora plazmīdā (sākotnējais vektors).
- Interesējošās DNS amplifikācija, izmantojot PCR.
- PCR produkta (interesējošā DNS) attīrīšana ar gēla elektroforēzi.
- Recipienta plazmīdas atvēršana ar tām pašām restrikcijas endonukleāzēm, kuras izmantoja interesējošās DNS atdalīšanai sākotnējā plazmīdā.
- Interesējošās DNS (gēna) ligēšana saņēmēja plazmīdā, lai izveidotu subklonētu plazmīdu.
- Subklonētā vektora transformācija kompetentā saimniekbaktērijā.
- Transformēto šūnu skrīnings.
- Plazmīdas DNS attīrīšana un izmantošana DNS sekvencēšanai vai gēnu ekspresijai, lai iegūtu vēlamos produktus.
Subklonēšanu veic gadījumos, kad tiek izolēts viens gēns no klonētās gēnu grupas vai ja interesējošais gēns ir jāpārnes noderīgā plazmīdā, lai redzētu precīzu interesējošā gēna funkciju.
Attēls_02: Subklonēšanas procedūra
Kāda ir atšķirība starp klonēšanu un subklonēšanu?
Klonēšana pret subklonēšanu |
|
| Klonēšana ir procedūra, kas rada ģenētiski identiskus organismus vai šūnas. | Subklonēšana ir interesējošā gēna pārvietošanas procedūra no viena vektora uz citu vektoru, lai redzētu gēna ekspresiju un iegūtu vēlamo gēna funkcionalitāti. |
| Apstrādāt | |
| Atdaliet interesējošo DNS no organisma un vienu reizi ievietotu vektorā un klonētu | Jau klonēta DNS ir atdalīta no pirmā vektora un ievietota otrajā vektorā un klonēta. |
| Ievietot kustību, izmantojot vektorus | |
| Nepārvieto ieliktņus (interesējošā DNS) no viena vektora uz citu vektoru. | Pārvietot ieliktņus no vecākvektora uz mērķa vektoru. |
Kopsavilkums - klonēšana pret subklonēšanu
Klonēšana rada ģenētiski identiskas šūnas vai organismus ar ievietoto interesējošo gēnu vai DNS. Tas notiek, atdalot un ievietojot interesējošo DNS vektorā un ekspresiju saimniekbaktērijā. Subklonēšanai ir līdzīgas darbības ar klonēšanu. Tomēr, veicot subklonēšanu, jau klonēts DNS fragments (interesējošais gēns) tiek ievietots vektorā un pārveidots par saimniekbaktēriju. Tā ir galvenā atšķirība starp klonēšanu un subklonēšanu.
