Galvenā atšķirība - PCR un DNS sekvencēšana
PCR un DNS sekvencēšana ir divas svarīgas metodes molekulārajā bioloģijā. Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir process, kas rada lielu skaitu DNS fragmenta kopiju. DNS sekvencēšana ir metode, kuras rezultātā tiek noteikta konkrēta DNS fragmenta nukleotīdu precīza secība. Šī ir galvenā atšķirība starp PCR un DNS sekvencēšanu. PCR ir viens no galvenajiem soļiem, kas saistīti ar DNS sekvencēšanu.
Kas ir PCR?
Polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) ir DNS amplifikācijas paņēmiens, ko izmanto molekulārajā bioloģijā. Tas rada tūkstošiem līdz miljoniem konkrēta DNS fragmenta kopiju. Šo metodi 1983. gadā izstrādāja Karijs Mulliss. Šajā paņēmienā pastiprināmais DNS fragments kalpo par veidni, un DNS polimerāzes enzīms pievieno komplementārus nukleotīdus praimeram, kas ir pieejams PCR maisījumā. PCR reakcijas beigās tiek sintezētas daudzas DNS parauga kopijas.
Ir dažādas PCR maisījuma sastāvdaļas, tostarp DNS, DNS polimerāze (Taq polimerāze), praimeri (forward un reverse praimeri), nukleotīdi (DNS veidojošie bloki) un buferis. PCR notiek PCR iekārtā, un iekārtā jāievada pareizais PCR maisījums un jāpalaiž pareizā programma. Šis paņēmiens ļauj no ļoti neliela DNS daudzuma izgatavot no tūkstošiem līdz miljoniem konkrētas DNS daļas kopiju.
PCR reakcijas notiek cikliski, veidojot redzamu daudzumu PCR produktu uz želejas. PCR reakcijā ir iesaistīti trīs galvenie posmi, proti, denaturācija, praimera atkausēšana un virknes pagarināšana, kā parādīts 01. Šīs trīs darbības notiek trīs dažādās temperatūrās. DNS pastāv divpavedienu formā ar ūdeņraža saitēm starp komplementārajām bāzēm. Pirms implikācijas divpavedienu DNS ir jāatdala viena no otras. To dara, dodot augstu temperatūru. Augstā temperatūrā divpavedienu DNS denaturējas atsevišķās virknēs. Tad primeriem vajadzētu būt tuvāk konkrētā fragmenta vai DNS gēna blakus esošajiem galiem. Primer ir īss vienpavedienu DNS gabals, kas ir komplementārs mērķa secībai. Priekšējie un reversie praimeri atlaidināšanas temperatūrā tiek savienoti ar komplementārajām bāzēm denaturētā parauga DNS blakus esošajos galos. Gruntskrāsām jābūt karstumizturīgām. Kad praimeri ir savienoti ar parauga DNS, taq polimerāzes enzīms ierosina jauno pavedienu sintēzi, pievienojot nukleotīdus, kas ir komplementāri mērķa DNS. Taq polimerāze ir karstumizturīgs enzīms, kas izdalīts no termofīlās baktērijas Thermus aquaticus. PCR buferis uztur optimālus apstākļus taq polimerāzes darbībai. Šīs trīs PCR reakciju stadijas tiek atkārtotas, lai iegūtu nepieciešamo PCR produkta daudzumu. Pēc katras PCR reakcijas DNS kopijas skaits tiek dubultots. Tādējādi PCR var novērot eksponenciālu amplifikāciju. PCR produktus var novērot, izmantojot gēla elektroforēzi, un tos var attīrīt turpmākiem pētījumiem.
Attēls 01: PCR reakcijas galvenie soļi
PCR ir vērtīgs instruments medicīniskajā un bioloģiskajā pētniecībā. PCR ir īpaša vērtība tiesu ekspertīzē, jo tā var pastiprināt DNS pētījumiem no sīkajiem noziedznieku paraugiem un izveidot kriminālistikas DNS profilus. PCR tiek plaši izmantots daudzās molekulārās bioloģijas jomās, tostarp genotipēšanas, gēnu klonēšanas, mutāciju noteikšanā, DNS sekvencēšanas, DNS mikromasīvu un paternitātes testu jomās utt.
Attēls 02: Polimerāzes ķēdes reakcija
Kas ir DNS sekvencēšana?
DNS sekvencēšana ir precīzas nukleotīdu – adenīna, guanīna, citozīna un timīna – secības noteikšana konkrētajā DNS fragmentā. Ģenētiskā informācija tiek saglabāta DNS sekvencēs, izmantojot pareizo nukleotīdu secību. Tāpēc ir ļoti svarīgi atrast precīzu nukleotīdu secību DNS fragmentā, lai zinātu par gēnu struktūru un darbību.
DNS sekvencēšanas protokols ietver dažādus procesus. Pirmais solis ir ieinteresētās DNS vai organisma genoma DNS izolēšana. Izmantojot PCR (kā aprakstīts iepriekš), vēlamais DNS reģions ir jāpastiprina. Pastiprinātais PCR produkts ir jāatdala ar gēla elektroforēzi un jāattīra. Pastiprinātie fragmenti tiek izmantoti kā sekvencēšanas veidnes. Sekvencēšanu var veikt pēc Sangera sekvencēšanas vai augstas caurlaidspējas sekvencēšanas metodes. Sangera sekvencēšanai nepieciešama iegūto DNS fragmentu kapilārā elektroforēze. Pareizo nukleotīdu secību var noteikt, manuāli nolasot autoradiogrāfus vai izmantojot automatizētus DNS sekvencērus.
Gēnu sekvencēšana veicināja cilvēka genoma projektu un veicināja cilvēka genoma kartēšanu 2003. gadā. Tiesu ekspertīzē DNS sekvencēšana ļāva identificēt personas, kurām ir unikālas DNS sekvences, un identificē noziedzniekus. Medicīnā DNS sekvencēšanu var izmantot, lai atklātu gēnus, kas ir atbildīgi par ģenētiskām un citām slimībām, atrastu defektīvus gēnus un aizstātu tos ar pareiziem gēniem. Lauksaimniecībā informāciju par dažu mikroorganismu DNS sekvencēšanu izmanto, lai ražotu transgēnas kultūras ar ekonomiski vēlamām īpašībām.
03. attēls: DNS sekvencēšana
Kāda ir atšķirība starp PCR un DNS sekvencēšanu?
PCR pret DNS sekvencēšanu |
|
| PCR process rada tūkstošiem līdz miljoniem ieinteresētā DNS fragmenta kopiju. | DNS sekvencēšana ir process, kurā tiek noteikta precīza nukleotīdu secība noteiktā DNS fragmentā. |
| Rezultāts | |
| PCR rada tūkstošiem līdz miljoniem konkrēta DNS fragmenta kopiju | Tā rezultātā noteiktā DNS fragmentā tiek iegūta pareizā bāzu secība. |
| DdNTP iesaiste | |
| PCR nav nepieciešami ddNTP. Tas izmanto dNTP. | DNS sekvencēšanai ir nepieciešami ddNTP, lai pārtrauktu šķipsnu veidošanos. |
Kopsavilkums - PCR pret DNS sekvencēšanu
PCR un DNS sekvencēšana ir ļoti svarīgi instrumenti daudzās molekulārās bioloģijas jomās. DNS fragmentu amplifikācija tiek veikta ar PCR metodi, savukārt DNS fragmenta nukleotīdu pareizo secību nosaka DNS sekvencēšana. Šī ir atšķirība starp PCR un DNS sekvencēšanu.
