Galvenā atšķirība - Microarray vs RNS sekvencēšana
Transkripts atspoguļo visu šūnā esošo RNS saturu, tostarp mRNS, rRNS, tRNS, degradēto RNS un nesadalīto RNS. Transkripta profilēšana ir svarīgs process, lai izprastu šūnu ieskatus. Ir vairākas uzlabotas metodes transkripta profilēšanai. Microarray un RNS sekvencēšana ir divu veidu tehnoloģijas, kas izstrādātas, lai analizētu transkriptu. Galvenā atšķirība starp mikroarray un RNS sekvencēšanu ir tāda, ka mikromasīvs ir balstīts uz iepriekš izstrādātu marķētu zondu hibridizācijas potenciālu ar mērķa cDNS sekvencēm, savukārt RNS sekvencēšana ir balstīta uz tiešu cDNS virkņu sekvencēšanu, izmantojot uzlabotas sekvencēšanas metodes, piemēram, NGS. Microarray tiek veikta ar priekšzināšanām par sekvencēm, un RNS sekvencēšana tiek veikta bez priekšzināšanām par sekvencēm.
Kas ir Microarray?
Microarray ir izturīga, uzticama un augstas caurlaidības metode, ko zinātnieki izmanto transkriptu profilēšanai. Tā ir vispopulārākā metode stenogrammu analīzei. Tā ir zemu izmaksu metode, kas ir atkarīga no hibridizācijas zondēm.
Paņēmiens sākas ar mRNS ekstrakciju no parauga un cDNS bibliotēkas veidošanu no kopējās RNS. Pēc tam to sajauc ar fluorescējoši iezīmētām iepriekš izstrādātām zondēm uz cietas virsmas (punktu matrica). Papildu sekvences hibridizējas ar iezīmētajām zondēm mikromasīvā. Pēc tam mikromasīvu mazgā un pārmeklē, un attēlu nosaka kvantitatīvi. Apkopotie dati ir jāanalizē, lai iegūtu relatīvos izteiksmes profilus.
Pieņem, ka mikromasīvu zondu intensitāte ir proporcionāla transkriptu daudzumam paraugā. Tomēr tehnikas precizitāte ir atkarīga no izstrādātajām zondēm, iepriekšējām zināšanām par secību un zondu afinitāti hibridizācijai. Tādējādi microarray tehnoloģijai ir ierobežojumi. Mikromasīvu metodi nevar veikt ar zemas pārpilnības transkriptiem. Tas nespēj diferencēt izoformas un identificēt ģenētiskos variantus. Tā kā šī metode ir atkarīga no zondu hibridizācijas, mikroarray tehnikā rodas dažas ar hibridizāciju saistītas problēmas, piemēram, krusteniskā hibridizācija, nespecifiskā hibridizācija uc.
Attēls 01: mikromasīvs
Kas ir RNS sekvencēšana?
RNS bises sekvencēšana (RNA seq) ir nesen izstrādāta visa transkripta sekvencēšanas tehnika. Tā ir ātra un augstas veiktspējas transkripta profilēšanas metode. Tas tieši nosaka gēnu ekspresiju un nodrošina dziļu transkripta izmeklēšanu. RNS sekvence nav atkarīga no iepriekš izstrādātām zondēm vai iepriekšējām zināšanām par sekvencēm. Tāpēc RNS seq metodei ir augsta jutība un spēja noteikt jaunus gēnus un ģenētiskos variantus.
RNS sekvencēšanas metode tiek veikta vairākos posmos. Šūnas kopējai RNS jābūt izolētai un sadrumstalotai. Pēc tam, izmantojot reverso transkriptāzi, jāsagatavo cDNS bibliotēka. Katra cDNS virkne ir jāsaista ar adapteriem. Pēc tam ligētie fragmenti ir jāpastiprina un jāattīra. Visbeidzot, izmantojot NGS metodi, jāveic cDNS sekvencēšana.
2. attēls: RNS sekvencēšana
Kāda ir atšķirība starp Microarray un RNS sekvencēšanu?
Microarray vs RNS sekvencēšana |
|
| Microarray ir izturīga, uzticama, augstas caurlaidspējas metode. | RNS sekvencēšana ir precīza un augstas caurlaidības metode. |
| Izmaksas | |
| Šī ir zemu izmaksu metode. | Šī ir dārga metode. |
| Liela paraugu skaita analīze | |
| Tas atvieglo liela skaita paraugu vienlaicīgu analīzi. | Tas atvieglo liela skaita paraugu analīzi. |
| Datu analīze | |
| Datu analīze ir sarežģīta. | Šajā metodē tiek ģenerēti vairāk datu; tāpēc process ir sarežģītāks. |
| Priekšzināšanas par secībām | |
| Šīs metodes pamatā ir hibridizācijas zondes, tāpēc nepieciešamas iepriekšējas zināšanas par sekvencēm. | Šī metode nav atkarīga no iepriekšējām secības zināšanām. |
| Strukturālas variācijas un jauni gēni | |
| Šī metode nevar noteikt strukturālās variācijas un jaunus gēnus. | Šī metode var noteikt strukturālas variācijas, piemēram, gēnu saplūšanu, alternatīvu splicēšanu un jaunus gēnus. |
| Jūtība | |
| Tas nevar noteikt atšķirības izoformu izteiksmē, tāpēc tam ir ierobežota jutība. | Tam ir augsta jutība. |
| Rezultāts | |
| Tas var radīt tikai relatīvus izteiksmes līmeņus. Tas nedod absolūtu gēnu ekspresijas kvantitatīvo noteikšanu. | Tas nodrošina absolūtos un relatīvos izteiksmes līmeņus. |
| Datu atkārtota analīze | |
| Lai veiktu atkārtotu analīzi, tas ir jāatkārto. | Secības datus var atkārtoti analizēt. |
| Nepieciešams īpašs personāls un infrastruktūra | |
| Mikromasīvam nav nepieciešama īpaša infrastruktūra un personāls. | RNS sekvencēšanai nepieciešama īpaša infrastruktūra un personāls. |
| Tehniskas problēmas | |
| Microarray tehnikai ir tehniskas problēmas, piemēram, krusteniskā hibridizācija, nespecifiskā hibridizācija, ierobežots atsevišķu zondu noteikšanas ātrums utt. | RNS seq tehnika ļauj izvairīties no tādām tehniskām problēmām kā savstarpēja hibridizācija, nespecifiska hibridizācija, ierobežots atsevišķu zondu noteikšanas ātrums utt. |
| Aizspriedumi | |
| Šī ir neobjektīva metode, jo tā ir atkarīga no hibridizācijas. | Novirze ir zema salīdzinājumā ar mikromasīvu. |
Kopsavilkums - Microarray vs RNS sekvencēšana
Microarray un RNS sekvencēšanas metodes ir augstas caurlaidspējas platformas, kas izstrādātas transkriptu profilēšanai. Abas metodes rada rezultātus, kas ir ļoti korelēti ar gēnu ekspresijas profiliem. Tomēr gēnu ekspresijas analīzei RNS sekvencēšanai ir priekšrocības salīdzinājumā ar mikroarray. RNS sekvencēšana ir jutīgāka metode zema daudzuma transkriptu noteikšanai nekā mikroarray. RNS sekvencēšana arī ļauj diferencēt izoformas un identificēt gēnu variantus. Tomēr vairums pētnieku izvēlas mikromasīvu, jo RNS sekvencēšana ir jauna un dārga tehnika ar datu uzglabāšanas problēmām un sarežģītu datu analīzi.
