Galvenā atšķirība - ziemeļu vs dienvidu vs rietumu blotēšana
DNS, RNS un proteīnu specifisku secību noteikšana ir būtiska dažāda veida molekulārās bioloģijas pētījumos. Gēla elektroforēze ir metode, kas atdala DNS, RNS un olb altumvielas pēc to izmēra. No gēla profiliem konkrēta DNS secība, RNS secība vai proteīns tiek atklāts ar īpašām metodēm, ko sauc par blotēšanu un hibridizāciju ar iezīmētām zondēm. Ir trīs dažādu veidu blotēšanas metodes, proti, dienvidu, ziemeļu un rietumu. Galvenā atšķirība starp ziemeļu dienvidu un rietumu blotēšanu ir molekulas veids, ko tā atklāj no parauga. Southern blotēšana ir metode, kas nosaka noteiktu DNS secību no DNS parauga. Northern blotēšana ir metode, kas nosaka noteiktu RNS secību no RNS parauga. Western blotēšana ir metode, kas nosaka konkrētu proteīnu no proteīna parauga.
Kas ir Southern Blotting?
Southern blotting metodi izstrādāja E. M. Southern 1975. gadā, lai identificētu konkrētu DNS sekvenci no DNS parauga. Šī ir pirmā blotēšanas metode, kas ieviesta molekulārajā bioloģijā. Tas ļāva noteikt konkrētus gēnus no DNS, specifiskus fragmentus no DNS utt. Southern blotēšanas tehnikā ir iesaistītas vairākas darbības. Tie ir šādi.
- DNS tiek izolēta no parauga un sagremota ar restrikcijas endonukleāzēm.
- Sagremoto paraugu atdala ar agarozes gēla elektroforēzi.
- DNS fragmenti gēlā tiek denaturēti atsevišķās daļās, izmantojot sārma šķīdumu.
- Vienpavedienu DNS tiek pārnesta uz nitrocelulozes filtra membrānu ar kapilāru pārnesi.
- Pārnestā DNS tiek pastāvīgi fiksēta uz membrānas.
- Fiksētā DNS uz membrānas tiek hibridizēta ar iezīmētām zondēm.
- Nesaistītā DNS tiek nomazgāta no membrānas, mazgājot.
- Rentgena filma tiek pakļauta membrānai un tiek sagatavots autoradiogrāfs.
Southern blotēšana tiek izmantota dažādiem molekulārās bioloģijas aspektiem. Tas ir noderīgs RFLP kartēšanā, kriminālistikas pētījumos, DNS metilēšanā gēnu ekspresijā, mutētu gēnu noteikšanā ģenētisko traucējumu gadījumā, DNS pirkstu nospiedumu noņemšanā utt.
01. attēls: Dienvidu blotēšanas tehnika
Kas ir Northern Blotting?
Northern blotēšana ir metode, kas izstrādāta, lai noteiktu konkrētu RNS sekvenci vai mRNS sekvenci no parauga, lai pētītu gēnu ekspresiju. Šo metodi 1979. gadā izstrādāja Alvins, Kemps un Stārks. Tā atšķiras no dienvidu un rietumu blotēšanas paņēmieniem vairāku darbību dēļ. Tomēr šo paņēmienu veic arī ar gēla elektroforēzi, blotēšanu un hibridizāciju ar īpašām marķētām zondēm un noteikšanu. Northern blotting tehnika tiek veikta šādi.
- RNS ekstrahē no parauga un atdala ar gēla elektroforēzi.
- RNS tiek pārnesta no gela uz blotēšanas membrānu un fiksēta.
- Membrānu apstrādā ar iezīmētu zondi, kas sagatavota no cDNS vai RNS (zonde ir komplementāra noteiktai secībai paraugā).
- Zonde tiek inkubēta ar membrānu, lai saistās ar noteiktu secību.
- Nesaistītās zondes ir nomazgātas.
- Hibridizēti fragmenti tiek atklāti ar autoradiogrāfu.
Northern blotēšana ir svarīgs rīks hibridizētas mRNS noteikšanā un kvantitatīvā noteikšanā, RNS degradācijas pētīšanā, RNS pusperioda novērtēšanā, RNS splicēšanas noteikšanā, gēnu ekspresijas pētīšanā utt.
2. attēls: ziemeļu blotēšana
Kas ir Western Blotting?
Western blotēšana ir metode konkrēta proteīna noteikšanai no olb altumvielu maisījuma, izmantojot marķētas antivielas. Tāpēc Western blot ir pazīstams arī kā imūnblots. Šo metodi Towbin et al ieviesa 1979. gadā, un tagad to regulāri veic laboratorijās olb altumvielu analīzei. Darbības ir šādas.
- Proteīni tiek iegūti no parauga
- Proteīnus atdala pēc to izmēra, izmantojot poliakrilamīda gēla elektroforēzi
- Atdalītās molekulas elektroporācijas ceļā tiek pārnestas PVDF membrānā vai nitrocelulozes membrānā
- Membrāna ir bloķēta nespecifiskai saistīšanai ar antivielām
- Pārnestās olb altumvielas ir saistītas ar primārajām antivielām (ar enzīmu iezīmētām antivielām).
- Membrāna tiek mazgāta, lai noņemtu nespecifiski saistītās primārās antivielas
- Saistītās antivielas tiek noteiktas, pievienojot substrātu un nosakot izveidojušās krāsainās nogulsnes
Western blotēšana ir noderīga, lai cilvēka seruma paraugā noteiktu anti-HIV antivielas. Western blot var izmantot arī kā apstiprinošu testu B hepatīta infekcijai un galīgo testu govju trakuma slimībai.
03. attēls: Western blotēšana
Kāda ir atšķirība starp Northern Southern un Western Blotting?
Ziemeļu vs dienvidu vs Western Blotting |
|
| Noteikts molekulas veids | |
| Northern Blotting | Northern blotēšana nosaka konkrētu RNS secību no RNS parauga. |
| Southern Blotting | Southern blotēšana nosaka konkrētu DNS secību no DNS parauga. |
| Western Blotting | Western blotēšana nosaka konkrētu proteīnu no proteīna parauga. |
| Geles veids | |
| Northern Blotting | Tas izmanto agarozes/formaldehīda želeju. |
| Southern Blotting | Tas izmanto Agarozes želeju. |
| Western Blotting | Tas izmanto poliakrilamīda gēlu. |
| Blottēšanas metode | |
| Northern Blotting | Šī ir kapilārā pārnešana. |
| Southern Blotting | Šī ir kapilārā pārnešana. |
| Western Blotting | Šī ir elektriskā pārsūtīšana. |
| Izmantotās zondes | |
| Northern Blotting | cDNS vai RNS zondes, kas marķētas radioaktīvi vai neradioaktīvi. |
| Southern Blotting | DNS zondes ir marķētas radioaktīvi vai neradioaktīvi. |
| Western Blotting | Primārās antivielas tiek izmantotas kā zondes. |
| Atklāšanas sistēma | |
| Northern Blotting | Tas tiek darīts, izmantojot autoradiogrāfu vai gaismas vai krāsas maiņas noteikšanu. |
| Southern Blotting | Tas tiek darīts, izmantojot autoradiogrāfu, gaismas vai krāsas maiņas noteikšanu. |
| Western Blotting | Tas tiek darīts, izmantojot gaismas vai krāsas maiņas noteikšanu. |
Kopsavilkums - ziemeļu vs dienvidu vs rietumu blotēšana
Blottēšana ir īpašs paņēmiens, kas izstrādāts specifiskas DNS, RNS vai proteīna identificēšanai no paraugiem. Ir trīs atsevišķas blotēšanas procedūras, proti, ziemeļu, dienvidu un rietumu, lai noteiktu noteikta veida molekulas. Northern blotēšanas metode ir paredzēta, lai noteiktu specifisku RNS secību no RNS maisījuma. Southern blot metode ļauj noteikt konkrētu DNS sekvenci no DNS parauga, un Western blot metode ir izstrādāta, lai identificētu konkrētu proteīnu no olb altumvielu maisījuma.
