Galvenā atšķirība - SYBR Green pret Taqman
SYBR Green un Taqman ir divas metodes, ko izmanto, lai noteiktu vai skatītu reāllaika PCR pastiprināšanas procesu. SYBR Green ir metode, kuras pamatā ir interkalācijas nukleīnskābju krāsošanas krāsa, savukārt Taqman ir metode, kuras pamatā ir hidrolīzes zonde. Abas tehnoloģijas ir izstrādātas, lai PCR laikā radītu fluorescenci, kas ļauj reāllaika PCR iekārtai uzraudzīt reakciju “reālā laikā”. SYBR Green metode tiek veikta, izmantojot fluorescējošu krāsvielu, ko sauc par SYBR green, un nosaka amplifikāciju, saistot krāsu ar ražoto divpavedienu DNS. Taqman tiek veikts, izmantojot divkārši marķētas zondes, un tas nosaka pastiprināšanos, zondi sadalot ar Taq polimerāzi un fluorofora izdalīšanos. Šī ir galvenā atšķirība starp SYBR Green un Taqman.
Kas ir SYBR Green?
SYBR Green ir fluorescējoša krāsviela, ko izmanto, lai krāsotu nukleīnskābes, īpaši divpavedienu DNS molekulārajā bioloģijā. SYBR Green metodi izmanto, lai kvantitatīvi noteiktu PCR produktus reāllaika PCR laikā. Kad tas saistās ar DNS, iegūtais DNS-krāsu komplekss absorbē zilo gaismu un izstaro intensīvu zaļo gaismu. Tas notiek strukturālo izmaiņu dēļ, kas rodas krāsvielas molekulā, saistoties ar divpavedienu DNS. Kad PCR rada arvien vairāk DNS, vairāk krāsvielu molekulu saistās ar DNS, radot vairāk fluorescences. Tāpēc fluorescence palielinās līdz ar PCR produkta uzkrāšanos. Tādējādi PCR produkta daudzumu var kvantitatīvi izmērīt, izmantojot SYBR Green fluorescences noteikšanu.
SYBR zaļo krāsu var izmantot arī DNS marķēšanai citometrijā un fluorescējošā mikroskopijā. Etīdija bromīds ir veiksmīgi aizstāts ar SYBR Green, jo etīdija bromīds ir kancerogēna krāsviela, kurai ir problēmas ar iznīcināšanu DNS vizualizācijas laikā gēla elektroforēzē.
SYBR zaļajai metodei ir priekšrocības un trūkumi. Šī metode ir ļoti jutīga, lēta un viegli lietojama. Tomēr, ņemot vērā tās spēju saistīties ar jebkuru divpavedienu DNS, nespecifiskā saistīšanās var izraisīt pārmērīgu PCR produkta kvantitatīvo noteikšanu.
01. attēls: SYBR zaļā tehnika
Kas ir Taqman?
Taqman ir alternatīva metode SYBR Green, lai uzraudzītu reāllaika PCR procesu. Šī metode ir atkarīga no Taq polimerāzes enzīma 5’–3’ eksonukleāzes aktivitātes, lai degradētu zondes jaunās virknes pagarināšanas un fluorofora atbrīvošanas laikā. Šajā metodē tiek izmantotas divējādi marķētas zondes, un tās pamatā ir zondes hidrolīze. Zondes ir fluorescējoši marķēti DNS oligonukleotīdi ar fluorescējošu reportiera molekulu (fluoroforu) 5' galā un slāpētāja molekulu 3' galā. Tie ir paredzēti, lai saistīties ar vienpavediena veidni grunts atlaidināšanas pretējā pusē. Taq polimerāze pievieno primeram nukleotīdus un paplašina jauno virkni pret divkārši iezīmētajām zondēm. Kad Taq polimerāze saskaras ar zondi, Taq polimerāzes eksonukleāzes darbība aktivizē un degradē zondi. Kad ir pabeigta jaunās virknes sintēze, zonde tiek pakļauta pilnīgai degradācijai un atbrīvo fluoroforu. Fluorofora izdalīšanās rada fluorescenci. Fluorescējošā Quencher molekula efektīvi slāpē izstaroto gaismu un rada izvadi PCR produkta kvantitatīvai noteikšanai. Fluoroforu izdalīšanās un PCR produktu daudzums ir proporcionāls. Tādējādi kvantitatīvu noteikšanu var viegli veikt ar Taqman metodi.
2. attēls: Takmana metode
Taqman metodi izmanto reāllaika PCR, gēnu ekspresijas kvantitatīvo noteikšanu, ģenētisko polimorfismu noteikšanu, hromosomu DNS delēciju kvantitatīvo noteikšanu, baktēriju identifikāciju, mikroarray analīzes pārbaudi, SNP genotipēšanu utt.
Kāda ir atšķirība starp SYBR green un Taqman?
SYBR Green pret Taqman |
|
| SYBR Green pamatā ir DNS saistoša krāsa. | Taqman ir atkarīgs no hibridizācijas zondēm un Taq polimerāzes 5’ līdz 3’ eksonukleāzes aktivitātes. |
| Fluorescējoši marķētas zondes | |
| Fluorescējoši marķētas zondes nav nepieciešamas. | Ir nepieciešamas divējādi marķētas zondes. |
| Multiplex gēnu analīze | |
| To nevar izmantot multipleksu gēnu mērķiem. | To var izmantot multipleksu gēnu mērķiem. |
| Izmaksas | |
| Tas ir lētāks. | Tas ir dārgāks. |
| Specifika | |
| Tas ir mazāk specifisks un saistās ar jebkuru divkāršu DNS | Tie ir ļoti specifiski, jo zondes nosaka specifiskos pastiprināšanas produktus. |
| Efektivitāte | |
| Tas ir mazāk efektīvs. | Tas ir ļoti efektīvs. |
| Pieteikums | |
| To izmanto reāllaika PCR, agarozes gēla vizualizācijā, DNS marķēšanā utt. | To izmanto reāllaika PCR, gēnu ekspresijas kvantitatīvai noteikšanai, ģenētisko polimorfismu noteikšanai utt. |
Kopsavilkums - SYBR Green un Taqman
Taqman un SYBR green ir divas metodes, ko izmanto reāllaika PCR (kvantitatīvā PCR). Abas metodes ļauj efektīvi noteikt PCR produkta daudzumu un paļaujas uz fluorescences emisiju. Taqman metodē uzkrātās DNS noteikšanai tiek izmantotas divkārši marķētas zondes, savukārt SYBR Green metode izmanto fluorescējošu krāsvielu. Abām šīm metodēm ir arī atšķirīgs pielietojums molekulārajā bioloģijā.
